Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир - Партасарати Рагувир

Еще с главы 1 мы наблюдаем, что у ДНК и остальных материалов живого организма биологическая функция неотделима от физической формы. Описывая восхитительные инструменты для чтения ДНК, я отметил, что их не удалось бы изобрести, если бы к ДНК не подошли как к физическому объекту, ведь они обязаны разрезать, наращивать, перемещать и отслеживать ДНК, учитывая ее вещественные характеристики и общие принципы самосборки и случайности. Это же относится и к редактированию генов – мы ведь вносим изменения в саму нить ДНК. Здесь, однако, мы работаем с этой молекулой внутри живых клеток, а не в спецаппарате, и потому используем другие подходы. В этой главе мы узнаем, как редактировать ДНК с помощью революционной технологии XXI века, называемой CRISPR/Cas9. Чтобы прочувствовать поразительные уникальность и мощь этого инструмента, имеет смысл рассмотреть вначале методы, предшествовавшие ему и примечательные сами по себе.

Герои этой саги о геномном редактировании – бактерии, способности которых уже не раз поражали нас в предыдущих главах. Многие виды бактерий, как и непритязательную рабочую лошадку E. coli, легко выращивать в огромных количествах в условиях лаборатории. В ведре с теплым питательным бульоном могут плавать триллионы E. coli, которые растут, делятся и производят уйму белков. Эти белки, закодированные в бактериальном геноме, расщепляют сахара, помогают клеткам перемещаться в жидкости, формируют мембраны и так далее. Что, если подарить E. coli человеческий ген, на основе которого она могла бы производить человеческий белок, например инсулин? Бактерия превратилась бы в миниатюрный фармацевтический завод – живой и способный к практически бесконечному самовоспроизводству.

Я не случайно привел в пример инсулин. У людей, страдающих сахарным диабетом I типа, не вырабатывается гормон инсулин, а значит, не регулируется уровень сахара в крови, что приводит к тяжелым нарушениям, порой даже фатальным. С 1920-х годов диабет компенсировали инсулином свиней и коров, который нужно было сложно и дорого очищать¹. Технологии совершенствовались, но даже в 1970-е для получения каких-то 450 граммов гормона требовалось переработать поджелудочные железы более чем 20 тысяч животных. Кроме того, из-за животного происхождения препарата у больных часто случались аллергические реакции. Подобно белкам Sonic hedgehog, с которыми мы встречались в главе 7, последовательности аминокислот в инсулинах человека и других животных очень похожи – похожи достаточно, чтобы выполнять свою функцию, – но все же они не идентичны, и эти незначительные различия вкупе со следовыми количествами примесей в животных экстрактах могут провоцировать мощный иммунный ответ. По всем этим причинам идея о массовом производстве человеческого инсулина казалась очень заманчивой. Однако на всем протяжении истории нашего вида до 1970-х люди оставались единственным крупным источником человеческих белков. Ситуация изменилась, когда мы научились перемещать гены от вида к виду, начав с трансформации бактерий.

Я немного задержусь на самом процессе превращения бактерий в машины, служащие нашим нуждам, поскольку лежащая в его основе философия сильно отличается от нашего подхода к небиологической инженерии. В комиксе «Кальвин и Хоббс» [61] шестилетний Кальвин спрашивает у отца: «Папа, как узнают, какую нагрузку выдержит мост?» Отец отвечает: «По нему пускают все более и более тяжелые грузовики, пока он не развалится. Затем последний грузовик взвешивают и восстанавливают мост». Кальвин поражен, а нам смешно, потому что это нелепо. Точно так же никому и в голову бы не пришло собирать автомобиль, случайным образом соединяя друг с другом детали – двигатель, оси, колеса и прочее – в поисках одной из миллиона комбинаций, способной стать рабочим транспортным средством. Зато в сфере биоинженерии такой подход вполне логичен благодаря способности биологических материалов к самосборке и их устройству из повторяющихся модулей.

В ходе эволюции бактерии обзавелись мощными инструментами для работы с ДНК, включая ферменты, называемые рестриктазами, которые разрезают двойную спираль. Разрезы вносятся не беспорядочно: каждая рестриктаза распознает специфическую последовательность нуклеотидов: как правило, ферменты «дрессируются» нападать на тот или иной участок, исходя из истории заражений бактериального вида вирусами, то есть геномами с характерными последовательностями ДНК. Иными словами, рестриктазы участвуют в защите от вирусного вторжения в ходе стародавней войны, к которой мы вернемся чуть позже. Большинство рестриктаз оставляют концы разрезанной ДНК не «тупыми», а «липкими» – это реальные научные термины, – чтобы им было проще удерживаться вместе с другими такими же концами. Липкость обеспечивается не каким-то клейким веществом, а контуром среза: с каждой из сторон разреза одна из цепей двухцепочечной ДНК выступает на несколько нуклеотидов относительно другой (см. рисунок). Выступающие концы разных фрагментов, полученных разрезанием одной и той же рестриктазой, могут связываться друг с другом по принципу комплементарности, то есть напротив A одного из них встает T другого, а напротив Ц – Г.

Другая особенность бактерий состоит в их склонности поглощать ДНК из окружающей среды, что позволяет им перенимать полезные черты у почивших соседей. Особенно часто и ловко бактериальные клетки обмениваются маленькими внехромосомными молекулами ДНК. Эти, как правило, кольцевые и способные к автономной репликации геномы, называемые плазмидами, есть у многих бактерий.

Позаимствовав описанный набор инструментов, мы сможем внедрить человеческий ген в бактерию. Сначала нужно добыть фрагмент ДНК, соответствующий интересующему нас гену, – например, гену человеческого инсулина. Можно либо воспользоваться природным вариантом из чьего-то генома, либо создать ген с нуля – такие небольшие цепочки нуклеотидов умели химически синтезировать даже в 1970-х. Как вы помните, благодаря ПЦР – еще одной технологии микробного происхождения (см. главу 1) – даже ничтожное количество ДНК можно размножить до миллионов идентичных копий. После размножения фрагмента ДНК с целевым геном внутри необходимо вырезать этот ген выбранной рестриктазой: она внесет нужные нам разрезы по обе стороны от него. Так образуется множество одинаковых копий гена с липкими концами. Параллельно нужно выделить из выращенных в огромном количестве бактерий плазмиды и расщепить их в одном-единственном месте той же рестриктазой. Если содержимое двух пробирок смешать, фрагменты целевого гена и «открытые» колечки плазмид будут перемещаться в водной среде, случайно сталкиваясь друг с другом в броуновском танце. Некоторые из них комплементарно свяжутся друг с другом и замкнутся в новые, более крупные колечки, состоящие из плазмидной ДНК и целевого гена (отмечен на рисунке изогнутыми отрезками) [62].

Некоторые колечки закрываются и без целевого гена, но вскоре мы увидим, что такие пустышки не играют роли. Главное, что нужная нам последовательность оказывается хотя бы в нескольких плазмидах. (Если приглядеться к рисунку, в остове ДНК можно заметить зазоры в точках соединения липких концов; они исчезают, когда бактериальный фермент ДНК-лигаза сшивает стыкующиеся нуклеотиды вставки и плазмиды.)

Далее необходимо доставить плазмиды в бактериальные клетки. Поглощение ДНК из среды – трансформация – само по себе происходит редко, но его можно стимулировать тепловыми или электрическими импульсами, которые открывают в бактериальной оболочке врéменные поры. И все же лишь у небольшой доли бактерий внутри окажутся исходные либо рекомбинантные (со встроенным геном) кольца ДНК. Можно, однако, провести отбор в пользу именно этих микробов, уничтожающий всех остальных. Ученые выбирают или создают плазмиды, содержащие полезные для работы гены, в том числе и те, что обеспечивают устойчивость хозяйской клетки к антибиотикам. Если бактерии после этапа трансформации поместить в среду с антибиотиком, в живых останутся лишь клетки с плазмидами. Если таких клеток мало, не беда: в питательном бульоне они превратятся в миллиарды. Разумеется, в части выживших бактерий окажутся плазмиды без вставки, но нехитрые техники определения размера или последовательности плазмидной ДНК позволят выявить и отбраковать такие варианты. В итоге мы будем размножать только правильные бактериальные клоны².