Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир - Партасарати Рагувир

По завершении всех описанных этапов ученые получают организм, которого не существовало прежде: бактерию, несущую и экспрессирующую чужеродный ген. В 1973 году лаборатории Стэнли Коэна из Стэнфордского университета и Герберта Бойера из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, работавшие над совместным проектом, объявили о первой успешной бактериальной трансформации³. Вскоре стал очевиден потенциал этого открытия: бактерии можно превращать в микроскопические конвейеры, производящие не свойственные им вещества. Поскольку инсулин был самой привлекательной целью, несколько лабораторий вступили в биоинженерную гонку, стремясь как можно скорее сконструировать бактериальных продуцентов этого гормона.

Группа Уолтера Гилберта из Гарвардского университета – того самого Гилберта, пионера секвенирования ДНК из главы 13, – получала ген инсулина из очищенной человеческой ДНК, но такой подход строго регламентировался. Из-за всеобщих опасений по поводу межвидового перемещения генов бурные дебаты в городском совете массачусетского Кембриджа, где находится Гарвардский университет, завершились введением моратория на все подобные работы. Один из членов совета позже сказал: «Я попытался разобраться в научной подоплеке, но пришел к выводу, что не способен дать обоснованную оценку риска. Когда я понял, что не могу решить, голосовать ли в пользу или против моратория, на научных основаниях, я обратился к политическим»⁴. Он выступил за введение моратория.

Тем временем в импровизированной лаборатории в нескольких километрах к югу от Сан-Франциско небольшой биотехнологический стартап вовсю использовал химически синтезированный инсулиновый ген, избегая нормативных и социальных коллизий, присущих работе с молекулами из человеческого организма. Атомное устройство нуклеотидов абсолютно идентично вне зависимости от способа их создания – молекула есть молекула, – но закон и общественность не всегда готовы это признать. Упомянутую молодую компанию, Genentech, основали Герберт Бойер и венчурный капиталист Роберт Суонсон. В августе 1978 года в ее биореакторах удалось впервые в истории получить человеческий инсулин бактериального происхождения⁵. Маленькая Genentech оформила партнерство с фармгигантом Eli Lilly, чтобы организовать клинические исследования, наладить масштабное производство и получить одобрение регуляторов здравоохранения. В 1983 году инсулин от Genentech вышел на рынок, фактически совершив революцию в лечении диабета и став первым генно-инженерным лекарственным препаратом для людей.

Бактериальное производство инсулина проторило путь к биологическому получению лекарств от широкого спектра заболеваний. Сегодня объем рынка биологических препаратов медицинского назначения превышает 250 миллиардов долларов. Инсулин, как и многие другие вещества, теперь производят в основном генетически измененные дрожжи, а не бактерии⁶. Дрожжи – тоже одноклеточные организмы, но они, как и мы, эукариоты. С дрожжами нас роднит целый ряд недоступных бактериям механизмов модификации белков. Инсулин синтезируется в нашей поджелудочной железе как единая аминокислотная цепь (см. главу 2), которая впоследствии разрезается на три части; две крайних части объединяются мостиком новой химической связи, а средняя выпадает. Бактерии не способны к таким химическим операциям, поэтому исследователи из Genentech закодировали два крайних фрагмента отдельными генами, чьи белки затем соединялись друг с другом. Метод с использованием дрожжей не столь заковырист и более продуктивен.

Чтобы научиться внедрять гены в эукариотические клетки, потребовались дальнейшие исследования и изобретения. Лишь немногие из эукариот имеют плазмиды, и эукариотические гены, как правило, встраивают в хромосомы, чтобы они надежно экспрессировались в составе общего генома. (Такой вариант модификации иногда предпочитают и в бактериальной инженерии: внедрение нужного гена в хромосому бактерии дает больше гарантий на его сохранение, поскольку плазмиды могут теряться при клеточных делениях.) Методы модификации эукариотических геномов развивают уже не один десяток лет, однако до недавнего времени они были неэффективными, неточными и трудоемкими. Все радикально изменилось лишь с появлением системы CRISPR/Cas9, поэтому я не стану подробно разбирать другие подходы, а ограничусь лишь общим обзором их тактики и примеров, где приложение таких усилий может быть оправданным.

Если представить эукариотический геном как огромную библиотеку с закрытым фондом – вроде Библиотеки Конгресса или частного собрания, – то наша задача состоит в том, чтобы как-то втиснуть на полку новую книгу. Мы могли бы оставить ее в общественном зале, но библиотекарь вряд ли отнесет ее на полку за дверью: эукариотические клетки не поглощают и не встраивают в свои геномы случайные обрывки ДНК. Наши шансы увеличиваются, когда библиотеку ремонтируют или перевозят на новое место, поскольку в суматохе нашу книгу могут подложить к остальным. Такую возможность предоставляют только что оплодотворенные яйцеклетки, пока в них не объединились родительские хромосомы. Если микроинъекцией ввести молекулы ДНК в формирующийся зародыш, они могут встроиться в геном⁷. Сразу после разработки эта техника редко оказывалась успешной и позволяла внедрять фрагмент ДНК лишь в случайные места генома, ставя под угрозу целостность генов. Дальнейшие усовершенствования повысили ее эффективность и даже привнесли во внедрение ДНК некоторую степень прицельности (таргетированности). Сейчас это стандартный метод создания трансгенных мышей, например, с генами флуоресцентных белков для слежения за клеточными функциями (см. главу 2).

Другой вариант решения библиотечной задачи – привлечь кого-то, кому будет легче проникнуть в библиотеку, – например, профессионального взломщика. Мы часто прибегаем к помощи вирусов. Вирусы запускают свои геномы в клетки и реплицируют их там либо в виде независимых молекул, либо в составе генома хозяина. Маленькие и проворные вирусы не склонны брать дополнительный груз, но немного лишнего генетического материала в них все же можно втиснуть, и тогда модифицированные вирусные частицы доставят его в клетки заражаемого организма. Вирусная доставка ДНК имеет преимущества перед микроинъекцией, поскольку все делает сам вирус, а не лаборант с тонкой иглой, и работать можно с разными типами клеток, а не только со свежеоплодотворенной яйцеклеткой. Но у этих методов сходные недостатки: они не особенно надежны и таргетны, то есть избирательность встраивания привнесенной вирусом ДНК невысока. Когда мы создаем трансгенных мышей, нам неважно, что доля успешных процедур далека от идеала. Мы проводим отбор и дальше изучаем только правильно трансформированных мышей. Но если мы хотим разработать лекарственный препарат для человека, наши требования к надежности и точности сильно ужесточаются.

Бактерии – даже те немногие из них, которые могут проникать в другие клетки и причинять им вред, – обычно не изменяют геномы эукариот. Но есть и редкие исключения. Почвенный микроб Agrobacterium tumefaciens заражает корни растений, когда у него появляется такая возможность. Эта бактерия отрезает особый фрагмент своей плазмидной ДНК (Т-ДНК) и вводит его в растительную клетку вместе с белками, которые направляют Т-ДНК в ядро и вынуждают растение задействовать механизм репарации (починки) ДНК, чтобы внедрить бактериального засланца в свой геном. В итоге синтезируются закодированные в Т-ДНК вещества, провоцирующие опухолеобразование на корнях и питающие бактерий⁸. Ученые создали модифицированную агробактерию, в которой опухолеродные гены можно заменять любыми допустимыми по размеру ДНК-фрагментами, превращая вредоносный организм в мощный и безопасный инструмент доставки генов в клетки растений.

Один из самых интересных примеров доставки ДНК с помощью Agrobacterium – генетическая модификация риса для борьбы с дефицитом витамина A. Недостаток этого витамина считается главной предотвратимой причиной детской слепоты: ежегодно он отбирает зрение у 250–500 тысяч детей⁹. Почти половина этих детей умирает в течение года после потери зрения, что становится трагическим подтверждением важности витамина A для здоровья в целом. Наш организм получает витамин A из некоторых продуктов животного происхождения и производит из разных предшественников, в том числе из бета-каротина, который придает оранжевый цвет овощам вроде моркови и батата. Бета-каротина, однако, нет в рисе, который благодаря своей дешевизне и обилию на рынке служит основным продуктом питания во многих регионах, где распространен дефицит витамина А. Побеги риса вообще-то способны производить бета-каротин: он синтезируется в листьях, где участвует в фотосинтезе. Но соответствующие гены не экспрессируются в крахмалистых зернах, которые мы как раз и едим.