Владимир Скулачев - Рассказы о биоэнергетике
Машина спрашивает, довольны ли мы ее работой. Мы в восхищении, но А. Драчев считает, что великоваты шумы, и просит машину усреднить данные. Еще несколько секунд, и появляется новый вариант нашей кривой — краше прежнего!
А ведь не зря А. Драчев убрал шумы! Теперь видно, что в действительности кривая генерации фотопотенциала состоит из трех фаз. Первая невелика по амплитуде и направлена противоположно основным фазам II и III. Она завершается быстрее, чем может измерить даже наша сверхбыстрая техника (время ее возникновения меньше 10-7 секунды). Фаза II заканчивается к сотой микросекунде, а фаза III — к двадцатой миллисекунде после вспышки.
Получив этот результат, мы решили заменить воду в ячейке на D2O, тяжелую воду, в расчете на то, что это замедлит фазы генерации фотопотенциала, которые связаны с переносом Н+ (известно, что все процессы, где участвует ион водорода, замедляются, если вместо него в среде присутствует ион дейтерия, D+).
Вспышка лазера, и на экране дисплея ЭВМ яркий зеленый лучик выписывает динамику фотоэффекта в D2O. Фазы II и III явно затянуты. А. Драчев приказывает машине рассчитать время, за которое фаза II достигает 50 процентов своей величины. Это время заметно больше в D2O, чем в Н2О. То же для фазы III.
Для наглядности программист вызывает из недр памяти ЭВМ кривую прошлого опыта (с обычной водой). На это уходит всего несколько секунд. Лучик рисует другую кривую, она ложится гораздо левее той, которая была только что получена в опыте с D2O.
А что с фазой I? К сожалению, ее скорость в D2O все еще слишком велика и потому ускользает от измерения.
Из опыта с D2O можно было заключить, что по крайней мере фазы II и III как-то связаны с переносом Н+.
Независимое подтверждение этого вывода было получено, когда мы сопоставили наши кривые с динамикой спектральных превращений бактериородопсина.
Как показали в свое время У. Стокениус и Д. Остерхельт, поглощение кванта света бактериородопсином ведет к весьма характерному изменению его окраски: сначала спектральный максимум бактериородопсина несколько смещается в красную область, затем происходит резкий сдвиг в противоположную (синюю) область, после чего максимум возвращается в исходное положение.
Так вот времена этих трех спектральных сдвигов оказались весьма сходными с тремя фазами обнаруженного нами фотоэлектрического эффекта: красный сдвиг неизмеримо быстр, синий — десятки микросекунд, возврат к исходному положению — десятки миллисекунд. Мы повторили спектральные измерения Стокениуса и Остерхельта в условиях нашего эксперимента и убедились в хорошей корреляции спектрального и электрического ответов.
Из работ А. Льюса было известно, что синий сдвиг в окраске бактериородопсина обусловлен отщеплением протона от атома азота в альдиминной группе бактериородопсина, а последующий обратный сдвиг — протонированием того же атома.
Теперь сопоставим основные факты, чтобы попытаться представить себе механизм генерации протонного потенциала бактериородопсином. Факты таковы:
1) бактериородопсин переносит протон через мембрану бактерии в направлении изнутри (из цитоплазмы бактериальной клетки) наружу, в омывающий бактерию раствор. Этот процесс сопряжен с поглощением кванта света;
2) свет вызывает изомеризацию ретиналевого остатка, прикрепленного к белковой части бактериородопсина через альдимин, который протонирован в темноте и депротонирован на свету;
3) процесс генерации потенциала при транспорте
протона складывается из трех стадий (фаз), сильно различающихся по своим скоростям;
4) каждой из этих фаз соответствует определенный спектральный переход, причем фаза II коррелирует с депротонированием альдимина, в то время как фаза III -- с последующим присоединением к нему протона.
Приняв во внимание все эти наблюдения, можно сформулировать следующую «минимальную» гипотезу.
Свет вызывает такое изменение в окружении протонированного альдимина, что его сродство к протону уменьшается, он отщепляется и затем выделяется в окружающий раствор. После этого окружение альдимина «нормализуется», он переходит в «темновое» положение и вновь приобретает способность связывать протон. Однако теперь уже протон может быть взят только из цитоплазмы бактериальной клетки, но не из внешнего раствора.
Почему же протон, сидящий в темноте на азоте альдимина, выделяется во внешнюю среду, а поглощается из цитоплазмы клетки?
Вероятно, в молекуле бактериородопсина есть два пути, проводящих протоны: один (выходной путь) из глубины мембраны в наружную среду, другой (входной) - из цитоплазмы в глубь мембраны.
В темноте протонированный альдимин находится в конце входного пути. Поглощение светового кванта вызывает изомеризацию ретиналя: остаток ретиналя как бы изламывается, так что прикрепленный к нему на конце атом азота альдимина выходит из контакта с входным путем и перемещается в некое новое положение. Оно в начале выходного пути. Здесь происходит депротонирование альдимина, и выделившийся ион Н+ перемещается наружу.
На следующем этапе происходит обратная изомеризация ретиналя, и альдимин вновь оказывается в конце входного пути, но уже в своей депротонированной форме. Из цитоплазмы по входному пути подтягивается ион Н+ и протонирует альдимин. Цикл завершается.
В рамках этой схемы фаза I фотоэлектрического эффекта есть не что иное, как перемещение протонированного альдимина при изомеризации ретиналя под действием света. Фаза II — перенос протона от альдимина наружу по выходному пути. Фаза III — перенос протона из цитоплазмы к альдимину.
Что требуется для проверки такой гипотезы?
Точное знание, во-первых, местоположения альдимина в темноте и на свету и, во-вторых, устройства входного и выходного путей. Задача это, конечно, сложнейшая, но не безнадежная. Можно даже сказать, что с расшифровкой аминокислотной последовательности и пространственной структуры бактериородопсина наметилась реальная перспектива ее решения. Лишь взяв этот барьер, мы сможем наконец составить чертеж простейшего биологического генератора — бактериородопсина.
Родопсин и зрение
Лаборатория погружена во мрак. Лишь в двух углах большого помещения, заставленного стеллажами с приборами, слабо лучатся красным светом фонари, которые привычнее было бы видеть в комнате фотографа. Привыкнув к темноте, начинаешь различать лица людей, освещаемые зеленоватым мерцающим светом, что струится с экранов осциллографов и дисплеев ЭВМ. Идет опыт на зрительном родопсине.
Да, мы должны были когда-нибудь прийти к этой проблеме. Ведь если столько сил отдано бактериородопсину, то велик соблазн применить ту же аппаратуру к его животному собрату, тем более что с ним связана одна из самых старых и удивительных загадок физиологии.
Животный родопсин был открыт на сто лет раньше бактериального. И тем не менее по сей день мы многого не знаем о его функции. Так не стоит ли сравнить два родопсина, благо функция бактериального белка твердо установлена?
Но что может быть общего у генератора протонного 4 тока в мембране галофильных бактерий и зрительного пурпура в сетчатке глаза?
Два родопсина разделяет дистанция огромного размера. И тем не менее, оказывается, они очень похожи! Вот основные черты этого сходства. Оба белка имеют дело со светом, оба поглощают этот свет ретиналем, привязанным к белку через альдимин. Этот альдимин в обоих случаях протонирован в темноте и депротонируется под действием светового кванта, вызывающего изомеризацию ретиналя. В довершение всего оба — мембранные белки, упакованные таким образом, что два конца полипептидной цепи торчат по разные стороны мембраны. Полипептидные цепи и того и другого родопсинов содержат большое количество спирализованных участков.
Родопсин и зрение
Получается, что животный и бактериальный родопсины прямо-таки близнецы! Как же это увязать с тем, что первый участвует в зрении животных, а другой в энергообеспечении бактерий? Конечно, бывает так, что близнецы выбирают себе разные профессии. Однако это может произойти лишь под давлением чрезвычайных обстоятельств жизни, как утверждают специалисты из центра по исследованию близнецов в Миннесоте. Обычно же близнецы посвящают себя сходным сферам деятельности.
Так, может быть, зрительный родопсин — фотоэлектрический генератор наподобие бактериородопсина?
На первый взгляд такая мысль может показаться странной по одной простой причине: зрительный родопсин, поглотив квант, срабатывает только один раз. В отличие от бактериального родопсина он необратимо обесцвечивается под действием света, теряя остаток ретиналя, который выделяется в воду. Регенерация окрашенного родопсина занимает минуты и потому не может идти ни в какое сравнение с бактериородопсиновым циклом, измеряемым миллисекундами. Ясно, что животный родопсин в противоположность бактериальному не в состоянии генерировать устойчивый ток.
