Владимир Скулачев - Рассказы о биоэнергетике
И вот теперь неожиданно оказалось, что работа по фосфолипидам — лишь небольшой и явно второстепенный аспект обширной бактериородопсиновой программы Кораны, в которой изучение белка занимает подобающее ему центральное место. Исследование структуры бактериородопсина Корана вел в полной тайне, без каких-либо устных или тем более печатных сообщений о промежуточных этапах расшифровки полипептида. Уверовав в свою счастливую звезду, он рассчитывал, по-видимому, «выиграть гонку у русских», которые в его предшествующей эпопее с синтезом гена не числились среди серьезных конкурентов.
Но на этот раз великий индус ошибся в своей тактике и проиграл. Вероятно, публикация частичной структуры бактериородопсина была жестом отчаяния, вызванным сообщением, что полная структура этого интереснейшего белка уже опубликована в советском журнале. Может быть также, здесь не обошлось без мысли о том, что статья на русском языке останется не замеченной западной публикой. Но и этот расчет не оправдался. Имя Овчинникова слишком хорошо известно за рубежом, чтобы подписанная им статья не привлекла внимания специалистов. Кроме того, уже весной 1979 года Ю. Овчинников, Н. Абдулаев, А. Киселев, М. Фейгина, Н. Лобанов и И. Назимов опубликовали полную аминокислотную последовательность бактериородопсина по-английски а ФЕБС Леттерз.
Корана все же завершил начатую работу и напечатал свою структуру спустя примерно год после статьи советских авторов в «Биоорганической химии». Данные двух лабораторий практически совпадали на протяжении всей 248-членной цепи. Лишь в нескольких местах обнаружились единичные различия, связанные, по-видимому, с тем, что советские и американские биохимики работали с различными разновидностями бактерий.
Так закончился важнейший этап структурного исследования бактериородопсина: была расшифрована последовательность аминокислот в его полипептидной цепи.
Но какова укладка этой цепи в мембране? На этот вопрос мог бы дать ответ рентгеноструктурный анализ кристаллов бактериородопсина. Однако получение кристаллов мембранного белка, совершенно нерастворимого в воде, — это пока что нерешенная задача. (Лишь в самое последнее время Д. Остерхельт сообщил о кристаллизации бактериородопсина, но еще не ясно, будут ли такие кристаллы пригодны для анализа.)
Правда, в мембране бактериородопсин существует в кристаллическом состоянии. Но это двумерный плоский кристалл. Толщина образца (около 50 ангстрем) здесь слишком мала, чтобы стало возможным применение классического рентгеноструктурного анализа. И тем не менее именно изучение природных двумерных кристаллов бактериородопсина позволило получить сведения о его пространственной структуре.
Р. Хендерсон в Кембридже, комбинируя электронную микроскопию с математическим анализом, определил трехмерную структуру бактериородопсина в фиолетовых бляшках — фрагментах бактериальной мембраны, содержащих этот белок. Выяснилось, что полипептидная цепь бактериородопсина семь раз пересекает мембрану. Она образует семь спиральных участков, причем длина каждого из них равна толщине мембраны. Каждый из таких участков формирует колонну, укрепленную перпендикулярно плоскости мембраны и пронизывающую всю ее толщу.
Хендерсон описал структуру бактериородопсина с точностью до 7 ангстрем. Этого недостаточно, чтобы определить пространственные координаты отдельных атомов. Однако общий контур молекулы и расположение отдельных ее частей уже могли быть описаны вполне надежно, И вновь, как и при расшифровке аминокислотной последовательности, бактериородопсин оказался первым мембранным белком, трехмерная структура которого была в общих чертах выяснена.
Сопоставив данные по трехмерной структуре и последовательности аминокислот, Овчинников предложил модель бактериородопсина, где полипептидная цепь образует семь спиральных колонн, причем можно определить примерное расположение каждой из 248 аминокислот этой цепи в пространстве. Такой анализ позволил, в частности, локализовать остаток ретиналя — окрашенную группировку, поглощающую свет. Выяснилось, что ретиналь прикреплен к аминогруппе лизина — аминокислоты, расположенной на 216-м месте, считая от одного из концов полипептидной цепи. 216-й лизин находится в глубине мембраны, точнее, в седьмой спиральной колонне на расстоянии примерно 1/5 пути от наружной поверхности мембраны к ее внутренней стороне.
Таковы сведения о строении молекулы бактериородопсина. Как видно, уровень наших знаний хотя и не достиг здесь еще атомного разрешения, но уже достаточен для того, чтобы приступить к созданию «рабочего чертежа» этого генератора тока.
Как же он работает?
Чтобы точно ответить на такой вопрос, нужно было бы проследить путь протона, переносимого бактериородопсином через мембрану за счет энергии поглощенного кванта света. Что известно по этому поводу?
Свет, поглощенный ретиналем бактериородопсина, вызывает изомеризацию ретиналя: в молекуле ретиналя появляется излом, которого до этого не было. Изомеризация сопровождается отщеплением протона от альдиминной группы в месте прикрепления ретиналя к белку. Затем самопроизвольно, без участия света происходит обратная изомеризация ретиналя и присоединение протона к альдимину.
«Минимальная» гипотеза о механизме работы бактериородопсина исходит из того, что протон, который отщепился под действием света от альдимина, переносится к наружной поверхности мембраны бактерии и выделяется во внешнюю среду. А вот протон, присоединяющийся к альдимину после обратной изомеризации ретиналя, поступает уже с противоположной стороны мембраны, то есть из воды, заключенной внутри бактериальной клетки. В результате оказывается, что один квант света вызывает перенос одного протона из бактерии во внешнюю среду.
Такова гипотеза, но как ее проверить? Ведь речь идет о переносе одного-единственного протона внутри сложной белковой молекулы, масса которой почти в 30 тысяч раз больше массы протона!
К счастью, оказалось, что отщепление протона от альдимина сопровождается обесцвечиванием бактериородопсина. По обесцвечиванию можно судить о том, когда начался процесс транспорта протона и сколько времени протон «находится в пути». Измерения с помощью быстродействующего спектрофотометра показали, что протон стартует через несколько микросекунд после поглощения бактериородопсином светового кванта, а общее время в пути — около десяти миллисекунд.
Час от часу не легче! Сначала мы обнаружили, что нам надо уследить за частицей в 30 тысяч раз более мелкой, чем ее носитель, а теперь выясняется, что время перемещения этой частицы измеряется тысячными или даже миллионными долями секунды. За это время протон проходит путь, равный 50 ангстремам, или 0;000000005 метра.
Невелика дистанция!..
А ведь нужно засечь местонахождение протона на промежуточных этапах его перемещения в белковой молекуле, если мы хотим начертить его траекторию и понять, почему он движется так, а не иначе. Значит, интересующие нас отрезки времени и расстояния в действительности еще меньше.
В решении этой на первый взгляд неподъемной проблемы помог метод, который уже однажды выручил нас, когда мы пытались наладить прямое измерение генерации электрического тока и напряжения мембранными белками.
Помните, как удалось зарегистрировать образование разности потенциалов бактериородопсином? Протеолипосомы, содержащие в свой мембране бактериородопсин, прикрепили к плоской искусственной мембране, по обе стороны которой были электроды. Освещение вызывало транспорт ионов Н+ через мембрану протеолипосом, что регистрировалось подключенным к электродам вольтметром как уменьшение количества положительных зарядов в том отсеке, куда обращена покрытая протеолипосомами сторона плоской мембраны.
Современная электрометрическая техника достигла таких вершин, что уже можно измерять генерацию разности потенциалов со скоростью 10-7—10-8 секунды. Это гораздо быстрее, чем время, затрачиваемое молекулой бактериородопсина на перенос одного протона через мембрану. Стало быть, само по себе измерение перемещений протона в мембране не встречает принципиальных трудностей. Но как это сделать практически?
Протеолипосомы, покрывающие поверхность плоской мембраны на отверстии радиусом около 1 миллиметра, содержат в общей сложности порядка миллиона молекул бактериородопсина. Проблема состоит в том, чтобы синхронизировать работу всех этих фотогенераторов, каждый из которых работает сам по себе. Оказалось, что в принципе и это можно сделать. Существуют лазеры, генерирующие световую вспышку продолжительностью менее 10-7 секунды. Если осветить молекулы бактериородопсина такой вспышкой, то все они сработают практически одновременно и только один раз.
