Надежда Полушкина - Диагностический справочник иммунолога
Определение резус-фактора
Для определения резус-фактора на дно пробирки помещают каплю стандартного реагента (сыворотки анти-Rho (D)) и каплю исследуемой крови.
Все тщательно перемешивают встряхиванием и переворачивают в течение 3 минут. В пробирку добавляют 2–3 мл изотопического раствора натрия хлора и перемешивают путем трехкратного переворачивания пробирок.
Если отмечается агглютинация в виде крупных хлопьев, это указывает на резус-положительную принадлежность, при отсутствии агглютинации реакция считается отрицательной.
При гемотрансфузии, кроме указанных методов, производят определение групповой и резусной совместимости донора и реципиента.
Глава 2 Неспецифическая иммунологическая реактивность
Неспецифическая иммунологическая реактивность определяется с помощью следующих реакций:
– гемолитической активности комплемента;
– определения в сыворотке пропердина;
– определения лизоцина;
– определения интерферона;
– определения миелопероксидазы и НСТ-теста;
– постановки реакции бласттрансформации.
Реакция связывания комплемента (РСК)
Реакция основана на способности комплемента присоединяться только к комплексу «антиген – антитело» и неспособности связываться ни с антигеном, ни с антителом.
Реакция протекает в 2 фазы. В первой фазе участвуют антиген, испытуемая сыворотка и комплемент. Это невидимая часть реакции. Во вторую фазу происходит индикация, в реакцию вводят гемолитическую систему (эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку). Если антиген и антитело являются комплементарными друг другу с формированием комплекса, связывающего комплемент, гемолиз в фазе индикации не происходит, и эритроциты оседают. Реакция считается положительной. В случае если антитело не оказалось специфическим и не произошло образования комплекса «антиген – антитело», свободный комплемент вступает в реакцию и дает гемолиз. Реакция расценивается как отрицательная. В настоящее время реакция ставится в различных модификациях.
Показанием для данного исследования является подозрение на генетические дефекты.
Снижение гемолитической активности комплемента может быть признаком такого заболевания, как системная красная волчанка, или указанием на наличие наследственного дефекта.
Определение уровня пропердина
Пропердин постоянно присутствует в определенных количествах в нормальной сыворотке крови. Это важный гуморальный фактор, участвующий в обеспечении бактерицидных, вируснейтрализующих и гемолитических свойств крови. Метод основан на способности пропердина связываться с различными полисахаридами.
Реакция бласттрансформации на неспецифические митогены
Эта реакция позволяет проводить функциональную оценку Т– и В-лимфоцитов, а также для контролировать использование иммуномодуляторов. Кроме этого, с помощью этой реакции изучается пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на неспецифические митогены, исследуется синтез иммуноглобулинов В-лимфоцитами, стимулированных поликлапальным В-клеточным активатором – митогеном лаконоса. Стимуляция синтеза иммуноглобулинов происходит только при взаимодействии Т-хелперов с В-лимфоцитами.
Реакция проводится в динамике с различными дозами митогена и не всегда свидетельствует о нарушении клеточно-опосредованного иммунитета.
Определение С-реактивного белка
Наличие в крови С-реактивного белка зачастую является показателем активности инфекционного процесса. Определение его проводится в реакции презентации с моноспецифической антисывороткой. Для этого капилляр заполняют на треть антисывороткой, затем добавляют аналогичный объем испытуемой сыворотки больного, тщательно перемешивают и инкубируют при температуре 37 °C. Через 2 часа учитывают предварительный результат. Окончательный результат определяют после выдерживания капилляров при комнатной температуре.
Глава 3 Оценка специфической реактивности
В основе лежит определение специфичности взаимодействия реакции «антиген – антитело», которая формирует иммунный ответ на чужеродный агент.
Методы оценки специфической реактивности:
1) определение клеточного иммунитета, Т– и В-лимфоцитов;
2) определение количества иммуноглобулинов;
3) определение циркулирующих иммунных комплексов.
Определение Т– и В-лимфоцитов
Для этого применяется несколько методов. Например, розеткообразование с эритроцитом барана или мыши. Розетка образуется в результате связывания поверхностных рецепторов с введенными в субстрат эритроцитами барана. Она состоит обычно из лимфоцита и 3–5 присоединенных эритроцитов.
Другой метод – метод мононуклеарных антител, для которого используются соответствующие моноспецифические сыворотки, различающиеся в клинической практике по СD-рецепторам:
– СD (3) – Т-лимфоциты;
– СD (4) – Т-лимфоциты хелперы;
– СD (8) – Т-лимфоциты супрессоры;
– СD (16) – WK (натуральные киллеры);
– СD (72) – В-лимфоциты.
Для исследования используются люминесцентный микроскоп и проточный цитометр. По количественному содержанию СD-рецепторов и их соотношению судят о врожденных или приобретенных нарушениях, которые имеют полиэтиологическую природу.
В норме число Т-лимфоцитов составляет 70–80 % от общего числа лимфоцитов периферической крови.
Их снижение отмечается при активности гепатита и системной красной волчанке.
Методы выявления В-лимфоцитов. К ним относятся:
– цитотоксическая реакция с антисывороткой против антигенов;
– иммунофлюоресцентные методы с меченными антисыворотками;
– непрямой метод обнаружения иммуноглобулиновых рецепторов, с использованием стафилококков, содержащих белок А;
– определение с помощью эритроцитов и других частиц;
– смешанный антиглобулиновый тест;
– образование розеток с микробами, покрытыми иммуноглобулинами.
Определение иммуноглобулинов в крови. Определение гуморального иммунитета производится следующими методами:
– радиальная иммунодиффузия в геле с моноспецифическими сыворотками по Манчини;
– нефелометрически с моноспецифическими сыворотками по Чиркину;
– иммуноферментный анализ (ИФА).
С помощью радиальной иммунодиффузии на агаровом геле по Манчини производится количественная оценка содержания JgA, JgM, JgG в сыворотке крови. Это необходимо для диагностики первичной и вторичной иммунной недостаточности, миеломной болезни, а также для проведения контроля иммуномодулирующего лечения.
Сущность метода заключается в том, что лунки агарового геля, содержащего моноспецифическую антисыворотку, заполняют антигеном (в нескольких разведениях с заранее известной концентрацией) и исследуемой сывороткой. Стандартный антиген диффундирует через гель и взаимодействует с антисывороткой, образуя вокруг лунки кольцо преципитации, диаметр которого пропорционален концентрации антигена. График зависимости квадрата диаметра кольца от концентрации антигена представляет собой прямую линию, по которой, зная диаметр кольца исследуемой сыворотки, легко определить концентрацию антигена.
На первом этапе постановки реакции производится подбор оптимальных соотношений моноспецифической антисыворотки и эталонной сыворотки.
На втором этапе определяется количество иммуноглобулинов в исследуемых материалах.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) широко применяется как в научных исследованиях, так и в практическом здравоохранении с диагностической целью.
Существует несколько вариантов постановки иммуноферментного метода. Иммуноферментные определения, по сравнению с другими исследованиями, имеют ряд преимуществ. К ним относится повышенная чувствительность к выявлению в исследуемом материале антител или антигенов в очень низких концентрациях, причем требуется минимум исследуемого материала (0,5 мл сыворотки обследуемого).
Этапы обследования ИФА.
1. Сорбция на твердую фазу антигена в лунки ИФА-планшета для выявления антител к нему.
2. Выявление специфических антител с помощью биопроб путем внесения в лунки планшета для ИФА.
3. Обеспечение инкубации системы в течение определенного времени, во время которого происходит специфическое взаимодействие антигена и антитела на твердой основе.
4. Внесение различных растворов.
5. Обеспечение появления окрашенного продукта, который можно выявить визуально или фотометрически. Сывороточная концентрация многих аутоантител изменяется во время острых и хронических заболеваний. Синтез аутоантител регулируется по принципу обратной связи с уровнем продукции соответствующих антигенов.
Могут появиться стойкие изменения в наборах аутоантител в соответствии с воздействием определенных антигенов. Ранее выявление подобных изменений в организме может остановить развитие патологического процесса. Для раннего выявления специфических иммунных отклонений в последние годы начали применять методы группы Эли-тест, основанные на твердофазном иммуноферментном анализе.
