Олег Каменев - Лечение пиявками. Теория и практика гирудотерапии
Лишь в 1985 году российскими учеными И. П. Басковой и Г. И. Никоновым был разработан способ получения слюны, основанный на способности пиявки выделять секрет в ответ на раздражение концентрированным раствором хлористого натрия соответствующих рецепторов области присоски. Второй способ был предложен М. Rigbi и соавторами в 1987 году и состоял в кормлении пиявки имитирующим кровь раствором. Пиявка вместе с раствором заглатывала и выделяемую слюну, а после кормления содержимое желудка выдавливалось и исследовалось. Этот метод чаще всего используется сегодня западными исследователями. Он позволил открыть многие из известных к настоящему времени соединений. Однако понятно, что содержимое желудка или, как его называют в работах западных авторов, «разведенная слюна пиявки» (leech diluted saliva), недостаточно точно отражает реальный состав секрета железистых клеток, поскольку содержит примесь веществ, выделяемых пищеварительными железами пиявки, бактерией-симбионтом или иной флорой.
Совместно с С. С. Сергеевой нами выполнена работа (материал патентуется), позволившая на основе электрофизиологических исследований разработать метод получения достаточного количества чистого секрета, лишенного каких-либо посторонних примесей. Животное при этом минимально травмируется и впоследствии способно к спариванию и размножению.
Полученный секрет оказался, как уже было указано, достаточно сложным комплексом, на 85–90 % состоящим из воды. В сухом остатке можно выделить три больших группы веществ:
• белки и пептиды;
• липиды;
• полисахариды.
И около 8 % соединений сухого остатка нами не идентифицировано.
Мы провели анализ динамики выделения гликопротеидов, полисахаридов, гирудина, бделлинов, дестабилазы и гиалуронидазы в секрете, полученном по методу М. Rigbi и соавторов в модификации И. П. Басковой (Баскова И. П. и др., 2001). Полученные результаты подтверждают данные И. П. Басковой и соавторов о том, что в процессе питания животное выделяет секрет различного состава. Мы считаем, что выделение на разных стадиях питания животного слюны различного состава функционально обосновано и обеспечивает решение различных задач. Сначала – разрушение тканей и микрососудов жертвы, затем – блокаду механизмов гемостаза, а на последнем этапе – противодействие защитным реакциям, развивающимся в тканях в ответ на повреждение. Полученные результаты дают достаточно серьезные основания считать, что железистые клетки неоднородны и вырабатывают секрет различного состава. Учитывая вышесказанное, нам представляется целесообразным объединить известные к настоящему времени биологически активные соединения медицинских пиявок в четыре группы.
2.5.1. Литические соединения
Они обеспечивают проникновение веществ слюны, разрушение тканей жертвы, расширение раны, расплавление микрососудов. Кроме того, литические соединения влияют на проницаемость межклеточного матрикса дермы. При фракционном отборе слюны в процессе питания пиявки вещества этой группы обнаружены нами только в первых и в средних, но не встречаются в последних порциях секрета. К этой группе мы относим ряд соединений, охарактеризованных ниже.
1. Пептидаза (дестабилаза) впервые выделена и описана в 1985 году (Баскова И. П., Никонов Г. И.). В литературе рассматривается как фермент, разрушающий определенный тип связей в молекуле белка – ε-(γ-глутамил) – лизиновых. ε-(γ-глутамил) – лизиновые-изопептидные связи, образующие поперечные сшивки («кросс-линкинги»), широко представлены в плазменных, мембранных и структурных белках.
В частности, этот тип связей образуется при стабилизации фибрина, а их разрушение обеспечивает фибринолитическую активность секрета. Пептидаза представляет собой чрезвычайно интересное соединение, способное воздействовать на функциональную активность различных клеток: эндотелиоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов, макрофагов и др.
2. Гиалуронидаза – фермент, катализирующий реакции гидролитического расщепления и деполимеризации гиалуроновой кислоты и родственных ей соединений – кислых мукополисахаридов. Учитывая, что гликозоаминогликаны гиалуроновой кислоты входят в состав базальной мембраны (на которой расположены клетки зародышевого слоя эпидермиса), межклеточного матрикса, а также базальных мембран капилляров, она играет большую роль не только как фактор проникновения, но и в возникновении последующих физиологических реакций. Следует отметить, что в составе слюны пиявки обнаружены две гиалуронидазы. Они отличаются по способности воздействовать на хондроитинсульфат.
3. Коллагеназа впервые выделена в 1987 году М. Rigbi и соавторами. Она вызывает гидролиз волокон коллагена I типа и сходна с коллагеназой человека. Возможно, коллагеназа участвует в ингибировании коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов.
2.5.2. Антигемостатики
Они препятствуют развитию механизмов свертывания крови, чем обеспечивают свободное истечение крови из поврежденных сосудов во время всего периода питания пиявки. Антигемостатики начинают выделяться с момента разрушения микрососудов и появления крови в ранке, поэтому обнаруживаются в средней фракции слюны. Попадая с кровью в кишечник животного, поддерживают ее в жидком состоянии. Следует отметить, что в составе секрета слюны пиявки обнаружены вещества, блокирующие все основные механизмы активации системы свертывания крови (первичный и вторичный). К числу соединений этой группы следует отнести следующие.
1. Калин – ингибитор адгезии и агрегации тромбоцитов, а также активации фактора Виллебранда. Впервые описан R. Munro и соавторами в 1991 году и имеет молекулярную массу в 65 кДа.
2. Апираза – ингибитор агрегации тромбоцитов инициированной АДФ. Впервые выделена в 1987 году M. Rigbi и соавторами. Описаны две ее изоформы – низко– и высокомолекулярная (45 и более 400 кДа соответственно). Более крупный фермент может быть олигомером мелкого, но также может быть и самостоятельным соединением. Наибольшая активность – при pН 7,5. Апираза вызывает гидролиз аденозиновых нуклеотидов (АТФ и АДФ), причем с примерно равной начальной скоростью.
3. Антагонист PAF (фактора активации тромбоцитов) – препятствует адгезии и активации тромбоцитов, миграции тромбоцитов и нейтрофилов в очаг поражения, а также сокращению гладкомышечных клеток. PAF представляет собой фосфоглицерид, выделяемый в процессе иммунологических реакций нейтрофилами, базофилами и макрофагами, а также в процессе специфической активации тромбоцитов. PAF является мощным медиатором воспаления и, выделяясь в области нанесения ран, инициирует гемостаз и воспалительную реакцию. Антагонист PAF впервые описали M. Orevu и соавторы (1992).
4. Ингибитор Ха фактора (FXaI – Factor Xa Inhibitor) – в каскаде белков плазменного гемостаза фактор Xа является ферментом, катализирующим превращение протромбина в тромбин в присутствии ионов Ca2+, фактора свертывания крови V на поверхности мембран активированных тромбоцитов или фрагментов разрушенных эндотелиальных и/или гладкомышечных клеток (иногда фактор Xа называют протромбиназой). FXaI впервые выделили из разбавленной слюны медицинской пиявки в 1988 году M. Rigbi и соавторы. Получен и рекомбинантный (искусственный) FXaI, который, как показали опыты на экспериментальных животных, оказывает защитное действие против венозного тромбообразования.
5. Гирудин – уникальный высокоспецифичный ингибитор фермента тромбина, с которым он образует прочный комплекс, тем самым блокирует все известные реакции, активатором в которых выступает тромбин:
• активацию фибриногена и превращение его в нерастворимый фибриновый сгусток;
• регуляцию V, VIII, XIII факторов свертывания;
• регуляцию компонентов системы комплемента;
• изменение функционального состояния клеток крови (моноцитов, нейтрофилов), в том числе и агрегацию тромбоцитов;
• изменение состояния эндотелиальных и гладкомышечных клеток кровеносных сосудов.
В настоящее время строение и механизм действия гирудина изучены достаточно подробно. Гирудин состоит из 65 или 66 аминокислотных остатков и имеет у пиявки более чем 20 изоформ, различающихся длиной полипептидной цепи и наличием или отсутствием некоторых аминокислотных остатков. Третичная структура ингибитора представлена тремя образованиями: компактным доменом (6–39 аминокислотных остатков) вблизи N-конца, образующим так называемое «ядро»; подвижными относительно ядра коротким пептидом (1–5 аминокислотных остатков) и длинным С-концевым хвостовым доменом (40–65 аминокислотных остатков). Методами генной инженерии получен рекомбинантный гирудин и фармацевтический препарат на его основе.
Гирудин взаимодействует с тромбином, блокирует два участка его активного центра. Тем самым блокируется доступ субстратов и, в частности фибриногена, к ферменту. За счет большого количества контактов между тромбином и гирудином образующийся комплекс исключительно прочен (Kd 10–14 M). Сродство этих веществ столь высоко, что гирудин ингибирует не только свободный тромбин, но и фермент, связанный с фибриновым сгустком.
