Александр Панчин - Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей
В 1961 году японский ученый Осаму Симомура выделил из медузы рода Aequorea красивый биолюминисцентный белок, светящийся синим300. Позже было установлено, что у медузы есть еще один белок, работающий с ним в паре. Мы его уже упоминали в предыдущих главах. Этот белок поглощает свет в синем диапазоне, а излучает в зеленом. Его назвали GFP (green fluorescent protein, или зеленый флуоресцентный белок). Если биолюминисцентным белкам нужен исходный продукт (субстрат), с которым они вступают в химическую реакцию для получения света, то GFP в таком субстрате не нуждается. Как это часто бывает в области фундаментальных научных исследований, в последующие тридцать лет GFP оставался практически бесполезным и интересовал лишь узких специалистов, изучающих механизмы его флуоресценции. До тех пор, пока внезапно этому белку не нашлось важнейшее применение, перевернувшее наши представления о молекулярной биологии.
В 1992 году американский ученый Дуглас Прэшер с соавторами установили последовательность гена GFP301. К сожалению, ученому самым обидным образом не хватило финансирования, чтобы после продолжить изучение гена. Прэшер едва сводил концы с концами: какое-то время он даже ездил на машине с надписью “ученому нужна работа" и принимал пожертвования. Тем временем геном GFP независимо заинтересовались ученые Мартин Чалфи и Роджер Цянь. Прэшер, полагая, что сам с изучением GFP не справится, согласился передать ген коллегам для проведения дальнейших экспериментов.
Чалфи тоже не купался в деньгах, но обладал изобретательностью, которая очень помогла ему в исследовательской работе. Например, его лаборатория не могла позволить себе флуоресцентный микроскоп (чтобы наблюдать свечение GFP внутри отдельных клеток), поэтому Чалфи приглашал к себе торговцев лабораторным оборудованием, брал у них микроскопы на “испытательный срок", делал нужные снимки и анализы, а потом возвращал приборы обратно, так ничего и не купив.
В 1994 году Чалфи и его коллеги, включая Прэшера, опубликовали в журнале Science статью о том, что с помощью генной инженерии можно соединять ген GFP с другими генами живых организмов, а по свечению определять локализацию кодируемых ими белков302. Впоследствии благодаря GFP стало возможно увидеть под микроскопом, как развивается нервная система, как клетки поджелудочной железы, производящие гормон инсулин, организуются в ходе эмбрионального развития, как белки транспортируются в клеточное ядро или из ядра и вообще из одной части клетки в другую, как раковые клетки распространяются по телу человека и так далее.
Тем временем сотрудники лаборатории Цяня обнаружили в гене GFP мутации, из-за которых белок становился более ярким303, а также мутации, меняющие цвет флуоресценции белка. Благодаря его исследованиям арсенал ученых пополнился желтыми, оранжевыми, красными и другими флуоресцентными белками и их генами. Впоследствии решение Прэшера “поделиться” геном GFP с коллегами принесло великую пользу науке, но стоило ученому Нобелевской премии, на вручении которой он присутствовал почетным гостем, а не лауреатом. Премию за GFP разделили Цянь, Чалфи и Симомура, люди, успевшие внести наибольший вклад в его изучение, что не отменяет заслуг первооткрывателя гена. Последовательность исходного гена GFP Прэшера из оригинальной публикации вы можете увидеть ниже.
Кроме мутационного подхода для создания новых форм светящихся белков, который использовали в лаборатории Цяня, есть еще один способ – поиск уже существующих в природе генов флуоресцентных белков (как это делал Доктор М). С этим подходом преуспели в лаборатории академика Сергея Лукьянова из Института биоорганической химии РАН. Ученые открыли ярко-зеленый флуоресцентный белок на щупальцах актинии Anemonia majano, желтозеленый белок на щупальцах мягкого коралла рода Zoanthus, сине-зеленый белок на полосах и красный белок на пятнах дисков “грибного коралла” Discosoma striata и другие белки304. Позже эксперименты с различными флуоресцентными белками и их мутантами позволили создать белок, со временем меняющий цвет флуоресценции от зеленого к красному305. При помощи этого белка можно изучать, как меняется локализация или концентрация в клетке других белков, соединенных с такими светящимися “молекулярными часами”.
Еще одну замечательную идею с использованием флуоресцентных белков придумала группа молекулярных биологов из Гарварда во главе с Джефом Лихтманом и Джошуа Сейнсом. В 2007 году они опубликовали в журнале Nature статью о новом методе исследования связей между нервными клетками мозга – Brambow™ (от слов brain – “мозг” и rainbow – “радуга”, то есть “мозговая радуга”). Метод основан на том, что в результате особой рекомбинации в отдельных нервных клетках генетически модифицированного организма оказывается свой уникальный набор генов флуоресцентных белков. Разные соотношения красных, зеленых и синих белков создают уникальные цвета, поэтому отдельные нейроны и их отростки окрашиваются по-разному. Это позволяет создавать удивительной красоты изображения структур мозга и видеть, какие нервные клетки соединены отростками.
Но вернемся к нашей текущей задаче – создать работающую плазмиду с флуоресцентным геном. Сначала мы спланируем ее на компьютере, а потом рассмотрим, как получить соответствующую последовательность ДНК в пробирке. В конце мы перенесем плазмиду в бактерию. Давайте выберем предложенный ген GFP или его аналог, цвет и яркость которого нам больше подходят, и последуем дальше.
Кроме гена GFP, нам понадобится ген, придающий бактерии устойчивость к какому-нибудь антибиотику. Такие гены могут кодировать белки, разрушающие или инактивирующие антибиотик, не впускающие его в клетку и так далее. Примеров и механизмов устойчивости известно множество, причем от разных антибиотиков защищают разные механизмы. После того как мы генетически модифицируем наши бактерии, мы захотим избавиться от тех, которые модифицировать не удалось, и антибиотик нам в этом поможет.
Для того чтобы гены работали, к ним нужно подобрать правильные регуляторные участки – промоторы и операторы, о которых мы говорили, обсуждая “синтаксис жизни". Выбор промотора зависит от того, какой организм мы модифицируем и хотим ли мы, чтобы ген работал постоянно или при определенных условиях. У бактерий и эукариот РНК-полимеразы разные и используют разные промоторы. Для того чтобы ген работал в клетках бактерий, перед ним часто ставят промотор бактериофага T7. Бактериофаги пытаются заставить бактериальную клетку полностью переключиться на производство вирусных РНК и белков, поэтому их промоторы очень эффективные (сильные) – с прилежащих к ним генов считывается много РНК. Если мы используем промотор T7, в нашей плазмиде должен быть еще один ген, а именно ген РНК-полимеразы бактериофага Т7, которая будет этот промотор обслуживать (связывать). Этот ген можно поставить под обычный бактериальный промотор. Известно множество разных промоторов, как сильных, так и слабых, а их последовательности можно найти в открытых базах данных и в научных публикациях. Ниже приведена последовательность промотора T7.
Для того чтобы синтез РНК в конце наших генов останавливался, после генов желательно разместить участки, которые называются терминаторами. Достигнув их, РНК-полимераза будет отсоединяться, прекращая синтез РНК. Это как знак пунктуации – точка в конце предложения. Для завершения работы над плазмидой потребуется еще один участок, который называется “ориджин репликации" – место, куда садится бактериальная ДНК-полимераза. Только при наличии такого участка плазмида сможет размножаться внутри бактерий. Наконец, между различными генами мы вставим небольшие участки ДНК произвольных последовательностей, чтобы отделить гены друг от друга.
Проект нашей плазмиды готов – пора создавать ее в пробирке. Сделать это можно несколькими способами. В принципе можно заказать плазмиду у какой-нибудь биотехнологической компании, которая сделает ее по нашим чертежам, используя современное оборудование и методы. Когда-нибудь в будущем устройства для синтеза произвольных последовательностей ДНК, в том числе плазмид, станут доступными для большинства людей, но пока что эти приборы очень дорогие. Здесь, конечно, ощущается некоторое жульничество. Что это за генные инженеры, которые не могут сами взять и все собрать?
Конечно, плазмиду можно собрать и самостоятельно, если она состоит из фрагментов других, уже готовых плазмид, геномов вирусов или бактерий, которые у нас хранятся в запаснике. Так поступали ученые, получившие от Прэшера ген GFP, – совмещали готовый ген с уже имевшимися генетическими конструкциями. Процесс сборки плазмиды можно сравнить с тем, как раньше писали анонимные письма, составляя тексты из слов, вырезанных из газет на свежем листе бумаги. Листом бумаги может выступить какая-нибудь существующая распространенная плазмида.
