Ричард Эвершед - Состав: Как нас обманывают производители продуктов питания
Еще один подход в рамках метаболомики заключается в том, чтобы определить присутствующие в составе меда летучие органические соединения (органические соединения, испаряющиеся при комнатной температуре) с целью установить его географическое происхождение. Летучие соединения улавливаются из воздуха прямо над медом методом микроэкстракции твердой фазы (SPME). Для этого используется нить с полимерным покрытием, удерживающим летучие соединения. Затем эти соединения сепарируются при помощи различных техник хроматографии и подвергаются дальнейшему анализу в масс-спектрографе. Данные по летучим соединениям, полученным из различных видов меда, используются для создания модели, позволяющей определить географическое и ботаническое происхождение этих разновидностей меда. После этого модель может быть использована для анализа новых разновидностей и определения их происхождения.
В 2014 г. группа исследователей из Дрездена применила метод SPME для анализа летучих соединений меда манука, а также идентичного ему по составу пыльцы меда канука и близкородственного меда, полученного из тонкосемянника истодолистного{10}. Ученые сопоставили результаты анализа летучих соединений с анализом нелетучих соединений методом HPLC и масс-спектрометрии. Были исследованы сложные химические отпечатки восьми образцов меда манука, семи образцов меда канука и одного образца меда тонкосемянника истодолистного. В результате применения хемометрического подхода, который подразумевает прогрессивные методы статистического анализа, ученым удалось определить характерную субстанцию каждого образца, что позволило разделить образцы на три группы. И хотя благодаря этой процедуре они смогли верно классифицировать каждый из проанализированных образцов, эта модель сработала лишь благодаря высокому качеству входных данных. Исследователи признали, что, несмотря на большой потенциал использованного метода, он пока не опробован на больших объемах. Для того чтобы с его помощью можно было определить подлинность любого меда, на этикетке которого значится слово «манука», необходимо собрать большую базу данных по образцам меда, произведенного в разные годы в разных частях Новой Зеландии. Тем не менее в деле установления подлинности меда метаболомику ждет большое будущее.
ДНК: идеальный метод анализа?
Может быть, геномика поможет разрешить загадку мануки? Для выявления пищевого мошенничества можно использовать уникальный генетический код любого вида, представляющий собой своего рода генетический, а не химический отпечаток. С аналитической точки зрения главное различие между химическим составом сахара и последовательностью извлеченной из него ДНК заключается в том, что ДНК содержит значительно больше информации. Если вернуться к аналогии с паролем, она является самым надежным паролем именно в силу своей специфичности.
Лаборатории всего мира каждый день секвенируют интересные им участки ДНК и даже целые геномы различных видов. И хотя это помогает ответить на конкретные вопросы, отсутствие стандартов в данной области отнюдь не способствует формированию общей базы данных, которую можно было бы использовать для идентификации видов животных и растений, включая и те, которые мы употребляем в пищу. В 2003 г. группа ученых из Гуэлфского университета в Канаде, работающая под руководством Пола Хеберта, предложила разработать специальные ДНК-штрихкоды, которые позволили бы быстро идентифицировать любой продукт органического происхождения. Подобно другим стандартам штрихового кодирования, таким как универсальный код товара (UPC) или европейский номер товара (EAN), используемым для идентификации розничных товаров, последовательность ДНК можно применять для определения видов – только вместо серии цифр он содержит серию нуклеиновых кислот. Этот метод определения принадлежности видов так же важен для биологии, как периодическая таблица элементов – для химии. Однако, в отличие от химических элементов, биологические виды вымирают быстрее, чем их успевают определять, к тому же на земле их миллионы! Хеберт и его команда предложили использовать штриховое кодирование как быстрый и простой метод, способный удовлетворить насущную потребность в идентификации живых организмов.
Код UPC в своем самом распространенном варианте содержит 12 цифр, для каждой из которых имеется 10 возможных значений (от 0 до 9). Это дает 1 трлн (10¹²) потенциальных комбинаций. В ДНК четыре основные составляющие: нуклеотиды аденин (A), гуанин (G), тимин (T) и цитозин (C). Ген, состоящий из 500 нуклеотидов, теоретически обеспечивает 4500 возможных вариантов штрихкода – более чем достаточно, чтобы каждому из всех живущих на земле видов досталось по одному.
Но какой же сегмент ДНК лучше всего подходит для создания штрихкода? Этот сегмент должен быть как можно более универсальным для различных таксономических групп и достаточно коротким, чтобы не доставлять неудобств в применении. Кроме того, он должен быть легко распознаваем, а начало и конец кода должны содержать отдельные гены, которые не слишком отличаются от вида к виду. Эти легко опознаваемые гены будут служить своего рода «закладкой» при обработке образца. При этом сам участок ДНК должен быть достаточно уникальным, чтобы по нему можно было определить видовую принадлежность, но не настолько уникальным, чтобы разные образцы, принадлежащие к одному виду, давали разный результат. Здесь как в сказке «Три медведя»: скорость мутации должна быть не слишком высокой и не слишком низкой, а как раз впору. Для решаемой нами задачи важно знать, что участки ДНК растений, которые можно использовать для создания штрихкода, содержат два хлоропластных гена, известные как matK и rbcL.
В простом случае из образца извлекается ДНК, которая затем подвергается обработке с целью увеличения концентрации интересующего нас гена. Этот метод носит название полимеразной цепной реакции (ПЦР). После этого образец помещают в ДНК-секвенсор, который выдает последовательность A, G, C и Т – своего рода штрихкод. Далее полученный результат можно загрузить в базу данных проекта «Штрихкод жизни» (Barcode of Life Database, BOLD), где они пройдут сравнение с существующими штрихкодами, принадлежащими уже установленным видам. Образец неустановленного вида либо выдаст совпадение с существующей последовательностью, либо окажется слишком отличным от всех остальных элементов базы и будет введен в нее в качестве нового элемента. Этот метод уже проверен и относительно недорог. Одна-единственная установка по штриховому кодированию ДНК может обрабатывать сотни и тысячи образцов в год, при этом затраты будут составлять около $10 на образец без учета оплаты труда и расходных материалов.
База данных по изученным образцам – ключевой элемент проекта «Штрихкод жизни». Помимо информации о последовательности нуклеотидов (собственно штрихкода) и названия вида, в ней содержится дополнительная информация о качестве и источнике происхождения каждого образца, а также о надежности проведенной идентификации. К примеру, образец, взятый в ботаническом саду и опознанный куратором, гораздо более надежен, чем некая древняя ДНК, извлеченная из фрагмента зерна, который нашли в осадочных породах на дне озера. Дополнительная информация помогает пользователям базы определиться со степенью надежности результатов исследования. Это важно учитывать при публикации научных открытий, а при расследовании случаев пищевого мошенничества такая информация позволяет убедиться в качестве доказательств.
Итак, можем ли мы использовать штриховое кодирование ДНК, чтобы установить ботаническое происхождение меда? Еще в 2010 г. Том Гилберт и его коллеги из Музея естественной истории (Natural History Museum) при Копенгагенском университете доказали, что даже в очень маленьких (объемом в 1 мл) образцах меда содержится достаточно ДНК-материала для проведения анализа методом ПЦР{11}. Они протестировали довольно много образцов меда и извлекли достаточно длинные участки ДНК, чтобы определить таксономическую принадлежность насекомых и растений, участвовавших в изготовлении этих образцов. Любопытно, что ДНК из пчелиных митохондрий (органоиды, отвечающие за производство энергии в клетке) преобладали в количественном отношении над ДНК из растительных органоидов (к примеру, хлоропластов). ДНК ядер растительных клеток была представлена в наименьшем объеме. Поскольку участки генома, подходящие для штрихового кодирования, располагаются в ДНК хлоропластов, ученые подтвердили, что метод анализа ДНК можно использовать для определения ботанического происхождения меда.
На момент написания этой главы Массимо Лабра и работающая под его началом группа исследователей из Университета Бикокка в Милане уже начали тестовое штрихкодирование образцов меда{12}. Они проанализировали четыре вида полифлерного меда, произведенного в четырех разных местах на севере Итальянских Альп, используя в качестве пограничных маркеров rbcL и еще один ген. Они собрали базу ДНК-штрихкодов для мест, где пчелы собирали нектар, – в общей сложности 315 видов растений. По ДНК, извлеченным из исследуемых образцов меда, они сумели опознать 39 видов растений, из нектара которых был изготовлен мед, – каштан, дуб, бук, а также множество трав. Неожиданной находкой оказалась ДНК ядовитого растения белладонны (Atropa belladonna). И хотя мед, скорее всего, не содержал никаких токсинов, производимых этим растением, данный пример наглядно демонстрирует потенциальную пользу, которую штрихкодирование ДНК может принести при оценке экотоксичности меда, а также решении других вопросов, связанных с безопасностью продуктов питания.
