Анатолий Смородинцев - Мир микробов
Но обычно в своей текущей работе микробиолог применяет более простой способ получения чистых культур — выделение их на плотных питательных средах. Оставьте в комнате на 10–15 минут тоненький ломтик картофеля и потом, предохранив его от высыхания, поместите на сутки в термостат. Вы увидите, что на поверхности ломтя появились мелкие округлые образования грязно-белого, жёлтого и красноватого цвета. Это так называемые колонии микробов, осевших из воздуха на поверхность картофеля и размножившихся там до видимых невооружённым глазом скоплений (колоний). Каждая колония — это миллиардное потомство одной особи, приставшей к влажной поверхности картофеля. Р. Кох первый обратил внимание на то, что таким путём можно легко выделить чистую культуру микроба, и предложил свой метод «пластинчатых разводок», в которых развивались отдельные колонии, происходящие из одиночных клеток. Кроме ломтей картофеля и моркови, Кох предложил применять в качестве плотной питательной среды питательный мясной бульон, к которому прибавлено 10 процентов желатины. Получается плотный студень, на котором прекрасно развиваются отдельные колонии (рис. 21). Но так как желатина разжижается при 22–26° и не может выдержать температуры термостата, при которой обычно выращивают болезнетворных микробов, то она была заменена агар-агаром, который также придает плотность питательной среде, но плавится только при 100°, а застывает при 40–45°.
Рис. 21. Колонии различных бактерий на плотной питательной среде
Кох разливал свои желатиновые питательные среды на стеклянных пластинках, которые покрывал затем стеклянными крышками. Но этот способ оказался непрактичным. Пластинки Коха легко зарастали посторонними микробами, попадавшими из воздуха. В 1885 г. уже упомянутый нами доктор Гейденрейх, которому русская микробиология обязана тщательной разработкой и усовершенствованием методов исследования микробов, предложил вместо коховских пластинок специальные двойные стеклянные чашечки с крышками, хорошо предохранявшие культуры от загрязнения. Позднее такие же чашечки были описаны в германском микробиологическом журнале зарубежным микробиологом Петри и незаслуженно получили в литературе его имя.
Теперь методика выделения чистых культур стала довольно несложным делом (рис. 22). Разливают в чашки Гейденрейха-Петри расплавленную агаровую питательную среду, которая уже через несколько минут превращается в плотную пластинку. Потом размазывают по поверхности пластинки при помощи простерилизованной платиновой петли или стеклянного шпателя материал, содержащий микробные клетки, и ставят чашку в термостат. Через сутки на поверхности агаровой пластинки вырастают отдельные колонии микробов. Из этих-то колоний с помощью стерильной петли и производится отсев чистых культур в колбы или пробирки (рис. 23), содержащие стерильную питательную среду.
Рис. 22. Выделение чистой культуры микробов:
А — разливка агара в чашки Гейденрейха-Петри; Б — посев смеси микробов в чашку; В — отсев колоний с чашек при помощи платиновой петли; Г — пересев в пробирку на поверхность скошенного агара
Рис. 23. Бактериальный рост на поверхности скошенного агара
После введения методов чистых культур в практику лабораторных исследований микробиология стала развиваться бурным темпом. Кроме питательных сред, приготовленных из мяса, картофеля, хлеба, солода, стали применять свёрнутый яичный белок, кровяную сыворотку, цельную кровь. На этих средах прекрасно росли многие болезнетворные и гнилостные микробы.
Однако вскоре оказалось, что применявшиеся среды пригодны для выращивания далеко не всех микробов. На них хорошо росли только микробы, привыкшие и в природных условиях усваивать сложные органические соединения. Когда учёные попытались исследовать различные биохимические процессы, происходившие в почве, и выделить чистые культуры почвенных микробов, то выяснилось, что на обычных средах вырастают только гнилостные микробы. Ни за что не удавалось выделить в чистой культуре и уже известных в то время микробов, так называемых нитрификаторов, окисляющих конечный продукт гниения белков — аммиак в соли азотной кислоты. А не располагая чистыми культурами микробов, учёные не могли разобраться в физиологии этих организмов. Не удавалось выделить и другую чрезвычайно важную группу почвенных микробов — азотфиксирующих бактерий.
Открытием методов культивирования этих микробов мы обязаны «отцу почвенной микробиологии», знаменитому русскому микробиологу С. Н. Виноградскому. Микробы-нитрификаторы не растут на плотных мясных средах потому, что они не могут использовать сложные органические соединения — решил Виноградский. Чтобы их вырастить, нужно приготовить раствор из простейших минеральных солей, содержащих аммиак в качестве единственного источника азота. В такой жидкости не будут расти обычные гнилостные микробы, неспособные довольствоваться столь простыми соединениями. Опыты блестяще подтвердили предположение Виноградского: процесс нитрификации исправно шёл в этой простейшей питательной среде. Но как выделить чистую культуру этих бактерий, не растущих на плотной питательной среде? И тут Виноградский применил следующий чрезвычайно оригинальный метод: он делал высевы не из выросших колоний, а из пустых мест чашки с плотной питательной средой, на которой была засеяна смесь, содержавшая нитрифицирующие бактерии. Он совершенно правильно предположил, что там оставались неразвившиеся нитрифицирующие бактерии. Прикасаясь к пустым местам платиновой петлёй и перенося материал в минеральный раствор, он постепенно получил в этой накопительной среде чистую культуру нитрифицирующих бактерий.
Метод избирательных сред, впервые предложенный Виноградским, сейчас прочно вошёл в практику выделения чистых культур разнообразных микробов. В связи с этим чрезвычайно усложнилась микробиологическая «кухня», в которой сейчас изготовляют сотни различных по своему составу сред, каждая из которых составлена соответственно узко специализированным природным потребностям микроба. Есть микробы, для которых мы до сих пор не умеем приготовить искусственные питательные среды, — это вирусы и риккетсии. О них мы узнаем в отдельной главе.
Но мало научиться разводить микробов. Чтобы проникнуть в тайну строения этих мельчайших существ, нужно их рассмотреть, изучить их форму и внутреннее строение. Нужно понаблюдать, как ведёт себя микроб в организме человека, животного и растения.
Что мог увидеть микроскопист начала прошлого века, изучавший капельку загнившей воды под своим примитивным микроскопом? В лучшем случае только форму наиболее крупных микробов. Он не мог разглядеть деталей внутреннего строения бактерий и уж, конечно, не видел ни одного, даже самого крупного вируса.
Первое усовершенствование было внесено во второй половине XIX века и заключалось в применении методов окраски микробов. Дело в том, что тело микробов жадно воспринимает некоторые краски. Поэтому микробы становятся хорошо видимыми на бесцветном фоне препарата. Введение методов окраски микробов позволило вскрыть многие подробности и показало, что простейшие существа часто имеют сложное внутреннее строение.
Но для того, чтобы хорошо окрасить клетку, её нужно предварительно убить. Таким образом, мы рассматриваем вместо живой клетки ее труп.
Как же разглядеть внутреннее строение живой клетки? До последних лет у нас не было хороших способов для исследования внутренней структуры таких мелких живых объектов, как бактерии.
Совсем недавно на помощь микробиологу пришли физики-оптики, сконструировавшие так называемые фазоконтрастные объективы, которые создают такой резкий световой контраст между различными составными частями клетки и самой клеткой и окружающей средой, что удаётся хорошо рассматривать живых микробов без всякой окраски. Фазоконтрастные объективы еще только входят в практику и, несомненно, раскроют нам новые, ранее неизвестные подробности строения этих существ. А главное — при помощи этих объективов можно очень чётко запечатлеть на фотопластинке неокрашенные микробы. Если же вместо фотокамеры присоединить к окуляру киносъемочный аппарат, а под объективом микроскопа поместить в маленькой влажной стеклянной камере тонкий слой питательной среды с развивающимися на ней микробами, то можно изучать жизнь микроба.
Советский микробиолог проф. В. Л. Троицкий недавно заснял этим методом замечательную кинокартину из жизни бактерий и открыл при помощи киноаппарата новые факты.
Он применил способ прерывистой съёмки, снимая не 16–18 кадров в секунду, как это делается при обычных немых киносъёмках, а только несколько кадров в минуту. Отпечатанная лента демонстрировалась на экране с обычной скоростью. Таким образом, перед зрителем предстали бактерии, развитие которых оказалось ускоренным в десятки раз. На глазах у зрителей бактерии очень быстро делились и образовывали колонию. Когда в питательную среду вводился вредно действующий на бактерии антибиотик — пенициллин, то было видно, как бактерии прекращали размножаться, вырастая в огромные, занимающие весь экран, толстые нити и шары, и, наконец, лопались и погибали. Этим методом проф. Троицкий вскрыл и причину приобретения микробами нечувствительности к пенициллину, что иногда снижает эффективность его лечебного действия. Оказалось, что у некоторых разбухающих и гибнущих под влиянием пенициллина бактерий остаётся небольшая часть клетки, приобретшая стойкость к антибиотику. Эта часть способна размножаться в среде, к которой добавлен пенициллин, и передаёт по наследству потомству свои вновь приобретённые свойства. Этим интересным опытом была наглядно доказана приложимость к бактериям общебиологического закона мичуринского учения о наследовании благоприобретённых признаков. Было опровергнуто мнение американских микробиологов — вейсманистов, считавших, что нечувствительность к антибиотику зависит от выживания единичных предсуществовавших в культуре стойких микробов.
