Николай Курчанов - Генетика человека с основами общей генетики. Учебное пособие
Иным направлением является использование альтернативных промоторов. В разных типах клеток с одного гена могут быть образованы разные белки. Так, ген белка дистрофина содержит 7 промоторов, которые считывают информацию, начиная с разных экзонов.
Большое значение в регуляции экспрессии генов у эукариот придается фактору метилирования ДНК внутри регуляторных областей. Метилированию подвергается цитозин в составе ЦГ-динуклеотида, что обычно приводит к инактивации гена. Деметилирование ДНК восстанавливает активность. Этот важный процесс регулируют ферменты метилтрансферазы.
Частным случаем регуляции на уровне транскрипции является гормональная регуляция, при которой гены «включаются» в ответ на внешний сигнал. Сигнал запускает экспрессию только тех генов, которые имеют специфические последовательности ДНК в своих регуляторных областях.
Весьма загадочным способом регуляции является геномный импринтинг – дифференциальное проявление отцовских и материнских генов в организме. Геномыбудто бы «запоминают» свое происхождение. Механизм этого явления не установлен.
С данным явлением схожа инактивация Х-хромосомы в соматических клетках женского организма млекопитающих. Правда, одна из двух Х-хромосом в клетках плода инактивируется случайным образом, поэтому в разных клетках женского организма экспрессируются как отцовские, так и материнские Х-хромосомы.
На процессы «включения» и «выключения» генов, их конденсации и деконденсации ощутимое влияние оказывают различные хромосомные перестройки, МГЭ, изменяющие эффект положения гена.
Для эукариот не характерна регуляция по типу оперона. Большинство м-РНК эукариот – моноцистронные. Более того, гены, контролирующие один метаболический путь, у эукариот часто разбросаны по всему геному. Но в этом правиле есть исключение. Гены р-РНК и митохондрий транскрибируются на единую транскрипционную единицу, которая разрезается после процессинга. Считается, что такой способ позволяет унифицировать регуляцию схожих генов.
Регуляция на уровне процессинга. У эукариот транскрипция гена еще не означает его проявления в фенотипе. Молекулы РНК, синтезированные в ходе транскрипции, у эукариот подвергаются существенным модификациям. Совокупность таких преобразований и составляет сущность процессинга.
На уровне процессинга в первую очередь необходимо отметить механизм альтернативного сплайсинга, позволяющий изменять порядок сшивки экзонов. Таким образом, на основе одной и той же нуклеотидной последовательности одного гена формируются разные белки, состоящие из разных сочетаний одних и тех же аминокислотных блоков.
Феномен альтернативного сплайсинга изменил наши представления о природе гена. Его распространенность оказалась значительно выше, а роль в эволюции – важнее, чем предполагалось первоначально. Альтернативный сплайсинг характерен для более чем трети генов человека. Так, на гене белка тропонина, содержащего 18 экзонов, за счет альтернативного сплайсинга может образовываться 64 различных белковых продукта. В среднем один ген человека кодирует около трех белков (Тарантул В. З., 2003).
Другим интересным способом регуляции на уровне процессинга является тканеспецифическое редактирование РНК. Оно обнаружено у микроорганизмов, грибов, млекопитающих и проявляется заменой отдельных нуклеотидов в молекуле РНК при помощи специального ферментного комплекса. Если в случае замены вместо смыслового кодона образуется стоп-кодон, то в новой полипептидной цепи будут отсутствовать все аминокислоты, идущие после него. Получается белок с совершенно новыми свойствами.
В ооцитах некоторых животных происходит накопление и-РНК, у которых не закончен процессинг. Такие РНК не транслируются. Окончание процессинга и последующая экспрессия наступают только после оплодотворения.
Примерно половина гя-РНК полностью распадается в ядре, не выходя за его пределы. Возможно распаду подвержены такие транскрипты, которые не способны превратиться в зрелую и-РНК.
Регуляция на уровне трансляции. Механизмы регуляции экспрессии на уровне трансляции изучены недостаточно полно. Избирательная трансляция м-РНК осуществляется отбором определенных м-РНК путем блокировки доступа к рибосомам.
В случае избирательной стабилизации определенных типов м-РНК в цитоплазме, они не подвергаются распаду после трансляции. Наглядным примером дифференциальной стабильности м-РНК может служить синтез белков глобинов на стабильных м-РНК безъядерных ретикулоцитов млекопитающих. Мутации, блокирующие полиаденилирование, наоборот, приводят к образованию очень нестабильных транскриптов. Обнаружены и другие механизмы, регулирующие стабильность м-РНК.
Регуляция на уровне посттрансляционной модификации белка. Посттрансляционная модификация полипептида и превращение его в функционально активную молекулу белка завершает процесс реализации генетической информации. Она представляет собой различные модификации определенных аминокислот (фосфорилирование, ацетилирование), удаление некоторых из них, и на этой основе формирование вторичной, третичной, четвертичной структуры белка. На посттрансляционном уровне также возможна регуляция экспрессии. Широко распространен механизм регуляции активности ферментов, основанный на присоединении молекул-эффекторов, в роли которых часто выступают конечные продукты биосинтеза.
В последние годы в геномах разных животных были обнаружены многочисленные РНК, выполняющие регуляторные функции. Они получили название риборегуляторов. Особое значение имеют короткие двунитиевые микро-РНК. Их способность ослаблять работу отдельных генов получила название РНК-интерференции.
Проблема регуляции экспрессии генов приводит к вопросу о координации этой регуляции: каким образом в каждой клетке происходит активация именно необходимой комбинации генов, определяющих ее фенотип? Для млекопитающих (в том числе и для человека) установлено наличие большого числа факторов регуляции надклеточного уровня, включая факторы нервной и эндокринной систем.
Глава 7. Генная инженерия
Законам природы люди повинуются, даже когда они борются против них.
И. Гете (1749–1832), немецкий мыслительГенная инженерия – это совокупность методов получения генов и переноса генетической информации из одних организмов в другие. В самом общем виде генно-инженерный процесс представляет собой различные операции над рекомбинантными ДНК, т. е. молекулами, объединяющими ДНК разных видов (Уотсон Дж. [и др.], 1986). Несмотря на разнообразие используемых подходов, в этом процессе мы можем выделить определенную последовательность этапов.
7.1. Выделение генов
Возможно использование нескольких путей выделения генов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.
Химический синтез генов, т. е. синтез нуклеотидов с заданной последовательностью, соответствующей одному гену, впервые был осуществлен в лаборатории Г. Кораны в 1969 г. (Agarwal К. [et al.], 1970). Это был ген аланиновой т-РНК дрожжей размером в 77 п. н. В то время это было выдающееся достижение науки. Еще более значительным событием стал искусственный синтез гена тирозиновой т-РНК, проведенный тем же исследователем в 1976 г. Этот ген включал области промотора и терминатора, а главное, он был биологически активен, т. е. работал при введении в клетку.
Уже в 1980-е гг. были успешно синтезированы функционально активные гены инсулина, соматостатина, интерферона. Прогресс в этой области позволил разработать специальные автоматы для синтеза ДНК определенной последовательности.
Получение отдельных генов из молекулы ДНК из природного генетического материала впервые осуществил Дж. Беквит в 1969 г. (Beckwith J., Zipser D., 1970), выделив гены лактозного оперона E. coli.
Главную роль в этом методе играют ферменты рестрикции (разрезания ДНК) – рестриктазы. Такие ферменты синтезируются практически всеми бактериями. Они относятся к группе ферментов-эндонуклеаз, которые делают разрезы в молекуле ДНК. Разные рестриктазы всегда разрезают ДНК в определенных местах – сайтах рестрикции, которые они способны узнавать. Собственная ДНК организма, продуцирующего рестриктазу, обычно модифицирована по участку узнавания, чтобы предотвратить саморасщепление. Модификация осуществляется посредством включения в ДНК бактерии модифицированных азотистых оснований особой ферментативной системой модификации. Ферменты рестрикции и модификации представляют собой единую систему. Эта система является своеобразным барьером, предохраняющим клетку от проникновения чужеродного генетического материала и включения его в собственный геном. Структура многих сайтов рестрикции-модификации в настоящее время расшифрована.
