Михаил Никитин - Происхождение жизни. От туманности до клетки
Структуры и функции белков
Большинство белков в клетках – водорастворимые, компактно свернутые молекулы. Укладка белковой цепи определяется порядком полярных и неполярных аминокислот в ней. Белки сворачиваются так, чтобы полярные аминокислоты находились на поверхности и контактировали с водой, а неполярные были скрыты внутри и контактировали друг с другом. Кроме того, цепь аминокислот благодаря водородным связям между C=O и N-H группами остова может образовать два типа упорядоченных структур: альфа-спираль и бета-слой (рис. 13.8). В альфа-спирали белковая цепь закручена вправо, на один оборот спирали приходится 3,6 аминокислот, и водородные связи образуются между соседними витками – через три аминокислоты. В бета-слое белковая цепь сложена в несколько параллельных прямых участков, и водородные связи образуются между соседними прямыми фрагментами цепи.
Эксперименты с искусственными белками показали, что пространственная укладка определяется в основном чередованием полярных и неполярных аминокислот в цепи. Так, для бета-слоя на поверхности белка нужно чередование «один через один» – АВАВАВАВ, так, чтобы все полярные группы аминокислот смотрели в одну сторону, а неполярные – в другую. Для альфа-спирали требуется повторение 7-аминокислотных фрагментов ААВВАВВ или АААВААВ, тогда одна сторона спирали будет полярной и обращенной к воде, а другая – неполярной внутренней.
Пять неполярных аминокислот (валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин) в значительной степени взаимозаменяемы между собой. Глицин и пролин стоят особняком, они не вписываются ни в альфа-спираль, ни в бета-слой и находятся в местах крутых поворотов белковой цепи между спиралями или между прямыми участками бета-слоя. 13 остальных аминокислот полярны и если обращены в воду, то тоже практически взаимозаменяемы. Таким образом, для расчетов трехмерной укладки белка можно в первом приближении считать, что аминокислот не 20, а только 3 – «полярная», «неполярная» и «поворотная». Это резко увеличивает вероятность получить белок с нужной укладкой случайным перебором: для белка из 100 аминокислот возможны 20100 вариантов последовательности, что намного больше числа частиц в видимой Вселенной. Но с точки зрения укладки вариантов только 3100 (приблизительно 1045), а осмысленных (с альфа-спиралями и бета-слоями) еще на много порядков меньше из-за необходимых для этого простых чередований аминокислот.
Эксперименты показывают, что коль скоро белок компактно свернут, то наличие у него какой-нибудь ферментативной активности – правило, а не исключение. Более того, активностей может быть несколько даже у короткого белка!
В опытах группы Майкла Хехта из Принстона изучались искусственные белки, складывающиеся в пучок из четырех альфа-спиралей (такую укладку имеют, например, цитохромы b – белки для переноса электронов и ферритины – белки для хранения железа). Ученые создавали на компьютере кодирующие последовательности для белков длиной 74 аминокислоты. 18 аминокислот между спиралями были всегда одинаковы и включали пролин и глицин, а альфа-спирали составлялись из 24 неполярных позиций (в каждой мог быть валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин) и 32 полярных (в каждой могла быть одна аминокислота из шести: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, лизин, гистидин, аспарагин, глутамин). При таких ограничениях возможно примерно 1041 вариантов последовательностей. Для 48 случайно выбранных виртуальных белков были синтезированы кодирующие их гены, вставлены в клетки кишечной палочки, и синтезированные белки удалось выделить и изучить. 60 % из них были компактно свернуты в пучки из четырех спиралей. Среди компактно свернутых белков половина связывала гем, подобно настоящим цитохромам, а 4 из 29 проявляли пероксидазную активность (т. е. окисляли субстраты с использованием перекиси водорода). Лучшая из четырех пероксидаз из этой случайной библиотеки лишь в 3,5 раза уступает по активности природным пероксидазам, прошедшим отбор!
В ходе дальнейших экспериментов была создана библиотека 400 случайных 4-спиральных белков длиной 102 аминокислоты. Из них более 90 % компактно сворачивались, 60 % связывали гем, 50 % проявляли пероксидазную активность. Кроме того, эти белки были проверены на другие ферментативные активности в отсутствие гема. Оказалось, что 30 % проявляют эстеразную активность[10], а 20 % – липазную. 3 % белков в этой библиотеке проявляли все три ферментативные активности, на которые их проверяли! (Patel et al., 2009).
В еще более масштабном поиске более миллиона 4-спиральных 102-аминокислотных белков были проверены на способность заменять природные ферменты кишечной палочки. Кодирующие их гены встраивали в штамм, лишенный необходимого фермента, и проверяли, возвращают ли они бактериям способность расти на минимальной питательной среде. Из 27 удаленных природных ферментов в библиотеке нашлись аналоги для четырех: фосфосерин-фосфатазы, цитрат-синтазы, треонин-деаминазы и энтерин-эстеразы (Fisher et al., 2011).
Эти данные показывают, что коль скоро белок свернут, то какая-нибудь ферментативная активность у него с высокой вероятностью будет. Более того, похоже, что эволюция современных белков ограничена в первую очередь опасностью появления новых нештатных функций, а не опасностью утраты основной функции. Поэтому, например, белки, работающие в митохондриях, эволюционируют в несколько раз быстрее, чем в среднем по клетке, даже если они кодируются ядерным геномом (подробнее о митохондриях – в главе 18). Ведь в митохондриях низкое разнообразие белков и мало потенциальных партнеров для нештатного связывания.
Древняя история белков записана в рибосоме
Выше мы рассказывали о разном возрасте деталей рибосомы по мере удаления от пептидил-трансферазного центра. Структуры рибосомных белков тоже меняются в зависимости от расстояния до центра. У кишечной палочки малая субъединица содержит 22 белка, обозначаемые S1-S22, а большая – 36 белков, от L1 до L36. Самые ближайшие к пептидил-транферазному центру и, по-видимому, древнейшие белки рибосомы – это протяженные выступы белков L2, L3, L4 и L22, заходящие глубже всего в рибосомную РНК. Укладка аминокислот в этих выступах либо не упорядочена, либо образует узкие бета-слои из двух параллельных белковых цепей (бета-шпильки). При этом отсутствуют обычные альфа-спирали, составленные закрученными вправо связями между амино– и карбонильными группами. Аминокислотный состав этих древнейших белков своеобразен: они на 70 % состоят всего из пяти аминокислот – глицина, аланина, пролина, аргинина и лизина (Hartman and Smith, 2014). В более молодых частях рибосомы белки образуют более широкие и упорядоченные бета-слои, и лишь в самых молодых белках на внешней поверхности есть альфа-спиральные участки. В аминокислотном составе второго поколения рибосомных белков (с широкими бета-слоями, но без альфа-спиралей) появляются в большом количестве валин и серин, а также ароматические аминокислоты. Внешние рибосомные белки, содержащие альфа-спиральные участки, по аминокислотному составу приближаются к усредненному составу всех клеточных белков, если не считать некоторого избытка лизина и аргинина.
Как мы помним, большая субъединица рибосомы поначалу работала в одиночку, без малой субъединицы и, следовательно, без матричной РНК. Она могла сшивать аминокислоты друг с другом, но не могла собирать из них длинные цепочки с определенной сложной последовательностью. Какие же пептидные цепи могла создавать проторибосома без матричной РНК?
Напрашивается три возможности. Во-первых, проще всего строить пептидные цепи из молекул одной аминокислоты, получая гомополимерный пептид. Во-вторых, можно использовать несколько (от двух до четырех) аминокислот, соединяя их в случайном порядке. Так образуются статистические пептиды. Третий и самый сложный вариант – когда проторибосома чередует две или больше аминокислот в постоянном порядке, производя периодический пептид.
Для гомополимерных пептидов сложно придумать какую-то функцию, которая будет востребована в мире РНК. А для периодических пептидов такие функции есть. Одну из них нам подсказывает структура рибосомных белков L2, L3, L4, L22. Эти белки состоят в основном из бета-шпилек, разделенных неструктурированными участками. Они несут положительный электрический заряд и стабилизируют укладку рибосомной РНК, компенсируя ее отрицательный заряд. Эту функцию почти так же хорошо могут выполнять периодические пептиды, полученные чередованием двухаминокислотных мотивов: (Ala-Arg) 2–4 – (Gly-Pro). Участки чередования аланина с аргинином образуют прямые части бета-шпилек, а пара глицин – пролин образует крутой поворот цепи, чтобы она могла сложиться в шпильку. Такие пептиды, которые могут встраиваться в крупные рибозимы и повышать стабильность их укладки, могли быть первым полезным продуктом пептидил-трансферазного центра. Еще более простой пример вспомогательного пептида с положительным зарядом упоминался в 10-й главе, это Tat-пептид вируса СПИДа. Этот пептид и его синтетические аналоги из повторов Arg-Gly и Arg-Gln-Gly тоже встраиваются в разные рибозимы, повышая стабильность их укладки и эффективность работы. Скорее всего, статистические пептиды такого состава тоже могут помогать работе рибозимов.
