Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир - Партасарати Рагувир
В самой интересной из новых технологий секвенирования ДНК, нанопоровой, не используют ни растущую ДНК, ни цветные нуклеотиды, ни даже ДНК-полимеразу11. Здесь можно пренебречь всем, что на последних страницах было написано о методах, в которых секвенирование привязано к синтезу, и вернуться к тому, с чего мы начинали: поочередно определять нуклеотиды на уже сформированной нити ДНК. Как мы помним, различать основания с помощью света невозможно, зато можно рассчитывать на электричество.
Представьте единственную пору нанометрового масштаба в мембране, разделяющей резервуар с жидкостью на два отсека. В водном растворе по обе стороны от нее содержатся ионы – электрически заряженные атомы или молекулы. При приложении к резервуару напряжения ионы начинают проходить сквозь пору, и силу этого электрического тока можно измерить. Если пора частично перекрыта, ток будет слабее – иными словами, сила тока показывает, насколько пора доступна ионам. Теперь представьте, что через пору протискивается нить ДНК. Ее основания – A, Ц, Г и T – различаются числом атомов и размерами, а следовательно, попадая в пору, по-разному снижают силу тока. Чтобы превратить этот принцип в метод секвенирования, нужно уметь оптимально протаскивать ДНК сквозь пору. В первых устройствах отрицательно заряженная по своей природе ДНК перемещалась, как и прочие ионы, под действием разности потенциалов на сторонах мембраны. Но работало это плохо – в основном потому, что молекула проскальзывала через пору слишком быстро и точно измерить силу тока при прохождении каждого нуклеотида не получалось. Как же решили эту проблему? Один из подходов задействовал белки. Существует немало белков, которые в норме передвигаются вдоль ДНК и совершают с ней какие-то действия, – например, ДНК-полимеразы или хеликазы. Если зафиксировать один из таких белков у входа в нанопору (на следующем рисунке изображен как светло-серые спирали12), он будет своим обычным рабочим инструментарием размеренно направлять ДНК в пору. Из главы 2 мы узнали, что многие белки можно считать природными машинами нанометровых масштабов. Здесь одну из них нагрузили работой в месте, недоступном для других исполнителей. Кроме того, белки способны формировать и сами поры: как мы выяснили в главе 2, многие пронизывающие мембрану белки могут укладываться так, что внутри них образуется сквозной канал. И вот мы снова наблюдаем самосборку.
Концепция нанопорового секвенирования проста, и еще в 1980-х в ней читались задатки перспективной технологии. Ее реализация, однако, потребовала немалых усилий. Сначала ученые показали надежность внедрения нанопор в искусственные барьеры – тогда еще не с целью секвенирования, а просто для понимания структуры пор и разработки платформ, позволяющих работать с мембранно-белковыми комплексами. Первые опыты по переносу ДНК через поры с помощью электрического поля помогли разобраться в физике движения в ограниченных пространствах. Хотя к началу 2000-х специалисты уже располагали основными принципами, многим сторонним наблюдателям, включая меня, было сложно разглядеть в нанопоровом секвенировании мощную и надежную технологию будущего. Необходимо было искусно скомпоновать поры, ДНК-связывающие белки, мембраны в несколько нанометров толщиной и электроды. Затем нужно было отработать высокочувствительные измерения силы тока и исключить при этом закупорку пор примесями или поврежденными белками. Эту пугающую инженерную задачу взвалила на себя компания Oxford Nanopore, которая занимается, как можно догадаться, в основном нанопоровой детекцией молекул. Первый прибор ученым представили в 2014 году – это была пилотная версия для оценки эффективности метода, – а теперь на рынке мы можем выбирать уже из нескольких разных аппаратов. Самый маленький сравним по размеру с большим пальцем или флешкой и, прямо как она, подключается к компьютеру через USB-порт. Привлекательность прибора во многом объясняется портативностью и низкой стоимостью. Например, в 2014-м с его помощью секвенировали геном эболавирусов, выделенных из 14 гвинейских пациентов. Его картировали уже через два дня после взятия проб, блестяще продемонстрировав потенциал скоростного секвенирования в полевых условиях. Эта технология позволяет оперативно выявлять источник распространения болезни и потенциально опасные варианты патогенов.
Недостаток нанопорового секвенирования в его не самой высокой точности: несколько процентов оснований может читаться некорректно, при том что метод Illumina допускает лишь около 0,1 % ошибок. Величина погрешности, правда, важна не всегда. При составлении подробной карты генома и в пренатальных анализах на точечные, но значимые мутации нам критически важно сводить число ошибок к минимуму. В мониторинге потенциально опасных патогенов и состава микробных сообществ сниженная точность метода вполне компенсируется его быстротой и удобством [56].
Прорывы в секвенировании ДНК оказались поразительными, и от будущего, вероятно, следует ожидать еще большего. Я уже упоминал рыночную стоимость этих технологий, а теперь давайте посмотрим, во что ученым обходится определение нуклеотидной последовательности образца ДНК. Удобной мерой будет стоимость секвенирования одного человеческого генома – иными словами, 3 миллиардов оснований. Как вы помните, на первый геном ушло 3 миллиарда долларов США, по доллару на основание. Уже к 2006 году затраты снизились больше чем на 99 % – примерно до 13 миллионов долларов. График изменения стоимости секвенирования во времени просто изумляет.
Вертикальная ось на этом графике логарифмическая, горизонтальная – обычная. Стоимость секвенирования снижается быстро и непрерывно13. Обвал 2007–2008 годов – удешевление в тысячу раз за полдесятилетия – знаменует переход к методам секвенирования нового поколения. Вместе со стоимостью стремительно сокращается продолжительность секвенирования одного генома – с нескольких лет в проекте «Геном человека» до нескольких дней при использовании современных техник.
С похожей скоростью, пожалуй, развивались технологии производства транзисторов. Первые транзисторы были капризными и громоздкими, миллиметрового масштаба. Теперь мы без труда помещаем миллиарды транзисторов на чипы площадью в квадратный сантиметр и стоимостью несколько долларов за штуку. В 1965 году Гордон Мур, впоследствии возглавивший компанию Intel, заметил, что количество транзисторов на чипе удваивается каждый год (позже он скорректировал оценку с года на два). Это наблюдение вошло в историю под названием «закон Мура» и служило одновременно описанием и манифестом электронных технологий. Прогресс в секвенировании ДНК, по крайней мере измеряемый затратами на чтение одного нуклеотида, был даже более стремительным. Неудивительно, что первым человеком, геном которого секвенировали с помощью Personal Genome Machine компании Ion Torrent, стал именно Гордон Мур. Революцию в технологиях секвенирования породило множество факторов: человеческая изобретательность, экономические стимулы компаний-производителей, государственное финансирование теоретических исследований и спецпрограмм, нацеленных на инновации в области секвенирования14, ну и, конечно, накопленные нами знания по биологии, химии и физике.
Последовательности ДНК сообщают нам немало информации: например, как на генетическом уровне различаются виды, особи одного вида, раковые и нормальные клетки. Тем не менее главной миссией технологий секвенирования может оказаться вовсе не чтение генов и геномов, а помощь в постижении внутренней жизни клеток.
