Георгий Дюльгер - Физиология размножения и репродуктивная патология собак
Влияние факторов внешней среды на активность и жизнеспособность спермиев. При работе со спермой вне организма необходимо четко представлять характер воздействия факторов внешней среды на активность и жизнеспособность спермиев и умело использовать эти знания на практике.
Температура. При нормальной температуре тела животного спермии проявляют высокую метаболическую и двигательную активность, но быстро погибают вследствие истощения энергетических запасов и накопления в плазме спермы продуктов обмена (молочной кислоты и др.). Повышение температуры опасно для спермиев. При температуре 46 °C и выше начинается коагуляция (свертывание) белков плазмы. Охлаждение спермы улучшает ее сохранность. При температуре 15 °C спермии становятся малоактивными и способны совершать только колебательные движения. При температуре 2…5 °C они впадают в состояние анабиоза. При нагревании охлажденной спермы до нормальной температуры тела животного их активность восстанавливается. Однако следует отметить, что резкое охлаждение спермы вызывает температурный (холодовый) шок — гибель и повреждение спермиев. При разбавлении спермы молочным разбавителем или специальными протекторными (защитными) искусственными средами, содержащими свежий желток куриного яйца, и при медленном охлаждении спермии не погибают от температурного шока. В естественной среде — плазме спермы — спермии не переносят замораживания. При разбавлении спермы криопротек-торной искусственной средой, содержащей глицерин, и соблюдении технологии замораживания большинство спермиев после размораживания сохраняет свою активность и оплодотворяющую способность. Срок хранения замороженной спермы исчисляется десятилетиями.
Свет. Прямой солнечный свет вреден для спермиев. Под его воздействием в плазме спермы в результате фотохимических реакций образуется токсичное для спермиев вещество — пероксид водорода. В отличие от крови плазма спермы не содержит перокси-дазы — фермента, разрушающего пероксид водорода.
Реакция, или рН, среды. Концентрация ионов водорода оказывает большое влияние на подвижность и жизнеспособность спермиев. Слабокислая среда подавляет обменные процессы в спермиях, слабощелочная, наоборот, активизирует обмен веществ в половых клетках. В слабокислой среде спермии впадают в состояние анабиоза уже при комнатной температуре. Нейтрализация кислоты, а также повышение температуры выводят спермии из анабиотического состояния, и они возобновляют движение. Сильные кислоты и щелочи даже в незначительных концентрациях вызывают гибель спермиев.
Осмотическое давление. Спермии очень чувствительны к изменениям осмотического давления среды, в которой они находятся. Осмотическое давление создается растворенными в воде веществами и зависит от их концентрации. Растворы, осмотическое давление которых такое же, как у спермы, называют изотоническими, меньшее — гипотоническими, большее — гипертоническими. Гипо- и гипертонические среды вызывают гибель спермиев. В гипотонических растворах спермии погибают от набухания, в гипертонических — от обезвоживания. Спермии хорошо сохраняют свою жизнеспособность в изотонических растворах многих солей и сахаров: 0,9%-м растворе хлорида натрия, 2,9%-м цитрата натрия, 1%-м бикарбоната натрия, 6%-м глюкозы и др.
Препараты, используемые при искусственном осеменении. По безвредности их подразделяют на абсолютно безвредные (глюкоза, цитрат натрия и др.), безвредные (лактоза и др.), относительно безвредные (хлорид натрия, бикарбонат натрия и Др.), условно безвредные (трис-буфер, глицерин, антибиотики и др.) и вредные (спирт, пероксид водорода и др.). В практике искусственного осеменения используют вещества, относящиеся к первым четырем группам. Абсолютно безвредные, безвредные и относительно безвредные препараты можно использовать в изотонических концентрациях, условно безвредные вводят в состав сложных искусственных сред в небольших количествах, чтобы повысить устойчивость спермиев к действию различных внешних факторов — замораживанию, контаминации микроорганизмами и др.
Оценка эякулята. Сперму получают только от здоровых, физиологически зрелых самцов в манеже с соблюдением ветеринарно-санитарных правил и не более 3 раз в неделю. При таком режиме можно получать до 2 млрд спермиев в неделю. Более интенсивное использование самцов-производителей приводит к их половому истощению и ухудшает качество получаемой спермы. Для хранения спермы в замороженном состоянии от собак обычно получают 2 эякулята с перерывом в 1…2 ч (в неделю).
Качество спермы оценивают сразу же после ее получения. Сперму исследуют макро- и микроскопически. При макроскопическом исследовании определяют ее объем, цвет, запах и консистенцию; при микроскопическом — активность спермиев, их концентрацию, процентное соотношение нормальных и патологических форм.
В норме сперма собак консистенции и цвета обезжиренного молока, без запаха. Сперму с неприятным запахом, загрязненную кровью (гемоспермия), мочой (уриноспермия), гноем (пиоспермия) выбраковывают. При выделении такой спермы самца-производителя тщательно обследуют, назначают соответствующее лечение и не допускают к использованию до полного выздоровления.
Активность спермиев определяют под микроскопом при температуре 38…39 °С, используя специальный обогревательный столик. На чистое предметное стекло наносят каплю спермы и накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю исследуют под микроскопом в неярком свете при увеличении 200…300 раз. Сперму оценивают визуально по десятибалльной шкале, определяя количество спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Высшую оценку 10 баллов получает сперма, в которой практически все спермии двигаются прямолинейно-поступательно. При оценке 9 баллов примерно 90% спермиев двигаются прямолинейно-поступательно, при оценке 5 баллов — 50% и т. д. Сперму, не содержащую спермиев, обозначают буквой А (аспермия), с мертвыми спермиями — буквой Н (некроспермия). Нормальная активность спермиев собаки составляет 7…10 баллов.
Концентрация спермы — показатель, который определяют при помощи счетной камеры Горяева, используемой для подсчета эритроцитов и лейкоцитов (наиболее простой и достаточно надежный способ), а также при помощи фотоэлектрического колориметра или автоматического счетчика клеток. Камера Горяева состоит из толстого предметного стекла, разделенного поперечными прорезями на три площадки. Средняя площадка ниже боковых на 1/10 мм и разделена продольной прорезью на две части, на каждой из которых выгравирована сетка. Каждая сетка состоит из 225 больших квадратов, из них 25 разделено на 16 маленьких квадратиков. Площадь маленького квадратика составляет 1/400 мм2. Если площадку накрыть шлифованным стеклом, то объем камеры маленького квадратика составит 1/400 мм3.
Для подсчета спермиев пробу спермы предварительно разбавляют 3%-м раствором хлорида натрия. В гипертоническом растворе хлорида натрия спермии становятся неподвижными (погибают), что облегчает подсчет. Сперму разбавляют в 100 раз при помощи эритроцитарного меланжера. Для этого в меланжер вначале набирают сперму до отметки 1, затем раствор хлорида натрия до отметки 101. Чтобы равномерно смешать сперму с раствором, концы меланжера зажимают между большим и указательным пальцами и встряхивают в течение 2…3 мин. Из пипетки меланжера удаляют первые 4 капли, не содержащие спермиев. Следующую каплю вносят под заранее притертое шлифованное стекло. Заряженную камеру Горяева кладут на столик микроскопа и исследуют под большим увеличением. Спермии подсчитывают в пяти больших квадратах (80 малых) по диагонали. Считают только головки спермиев, расположенные внутри малых квадратиков, а также на их левых и верхних линиях. Число спермиев, подсчитанных в пяти больших квадратах, суммируют и делят на 200. При делении получается цифра, выражающая содержание спермиев (млрд в мл).
Концентрация спермы собак может сильно варьировать — от 25 млн до 400 млн клеток в 1 мл. По этой причине качество спермы оценивают не по ее концентрации, а по числу активных спермиев в эякуляте.
Ценным показателем служит процентное соотношение нормальных и патологических форм спермиев. Чтобы определить их соотношения, наносят на край обезжиренного, сухого, чистого и теплого предметного стекла 1 каплю спермы и 2…3 капли 0,9%-го раствора хлорида натрия. Капли быстро перемешивают стеклянной палочкой и делают при помощи шлифованного стекла тонкий мазок. Мазок высушивают, фиксируют несколько минут 96%-м спиртом и окрашивают не менее 5 мин 1…2%-м раствором эозина. Раствор краски готовят на 2,9%-м растворе цитрата натрия. Краску на стекле смывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Просохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении в 400…600 раз и подсчитывают в нескольких полях зрения не менее 200 спермиев. Число нормальных и патологических форм спермиев по каждому полю зрения суммируют и определяют их процентное соотношение.
